感染症を検出するための従来の診断戦略では、ポイント オブ ケア テスト (POCT) には適していない卓上機器を使用する必要があります。新興のマイクロフルイディクスは、高度に小型化、自動化、および統合された技術であり、迅速、低コスト、正確なオンサイト診断のための従来の方法に代わる可能性があります。分子診断法は、病原体検出の最も効果的な方法として、マイクロ流体デバイスで広く使用されています。このレビューでは、感染症のマイクロ流体ベースの分子診断における最近の進歩を、学術的および産業的な観点からまとめています。まず、サンプルの前処理、増幅、信号読み取りなど、核酸の典型的なオンチップ処理について説明します。次に、4 種類のマイクロ流体プラットフォームの特性、長所と短所を比較します。次に、核酸の絶対定量のためのデジタルアッセイの使用について説明します。古典的および最近の商用マイクロ流体ベースの分子診断デバイスの両方が、市場の現状の証拠としてまとめられています。最後に、感染症のマイクロ流体診断の将来の方向性を提案します。
感染症は、世界中に分布する細菌、ウイルス、寄生虫などの病原体によって引き起こされます。他の病気とは異なり、病原体は急速に感染し、接種、空気、水媒体を通じて人間と宿主動物の間で広がります [1]。感染症予防は公衆衛生対策として重要です。感染症と闘うための 3 つの主な戦略: (1) 感染源を制御する。(2) 伝送路の遮断。(3) 影響を受けやすい集団の保護。主な戦略の中で、感染源の制御は、その利便性と低コストにより、最も重要な戦略と考えられています。感染した個人の迅速な診断、隔離、および治療は重要であり、迅速で感度が高く正確な診断戦略が必要です [2]。感染症の現在の診断は通常、徴候や症状に基づく臨床検査と、細胞培養や分子診断などの実験室での研究を組み合わせたものであり、訓練を受けた人員、労力のかかる手順、高価な検査機器が必要です [3、4]。感染症の発生を防ぐには、緊急事態が予測できない荒野や戦場での治療と同様に、特に感染症が一般的で深刻なリソースが限られている地域では、迅速で安価で正確な局所診断が必要です [5]。.医療は限られている [6]。この文脈では、マイクロフルイディクスは、微小電気機械システム技術、ナノテクノロジー、または材料科学を組み合わせて正確な流体操作を行う技術であり [7,8,9,10]、ポイントオブケア検出 (POCT) の新しい可能性を提供します。) 病院や研究所の外の感染因子。従来の時間のかかる診断と比較して、マイクロ流体技術は、病気の発生時に分子診断のサンプルとコストを節約します。コロナウイルス病 2019 (COVID-19) の世界的な蔓延は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) によって引き起こされているため、パンデミックのタイムリーな予防と制御のためのマイクロ流体工学の重要性が再び強調されています [11, 12 、13]。従来の診断とは異なり、マイクロ流体 POCT では、ベンチトップ アナライザーから小型のサイドストリーム テスト ストリップまで、小型のポータブル デバイスを使用して、サンプリング ポイントの近くでテストします [14]。これらのテストは、単純化されたサンプル前処理またはサンプル前処理なし、迅速なシグナル増幅、高感度のシグナル読み取りを特徴としており、短時間で正確な結果が数分以内に得られます。マイクロ流体ベースのヘルスケア機器の可用性と大量生産により、費用対効果の高い直接診断アプリケーションが病院の外、患者の近く、さらには自宅にまで拡大しました。
感染症を診断するための既存の戦略の中で、分子診断は最も感度の高いものの 1 つです [15、16]。さらに、分子診断は、COVID-19 を継続的に検出するためのゴールド スタンダードとしてよく使用され、免疫応答が始まる前に RNA または DNA のウイルス特異的領域を直接検出することができます [17, 18]。現在のレビューでは、学術的観点から将来の産業的観点まで、感染症のマイクロフルイディクスに基づく分子診断プロセスの最新の進歩を紹介します（図1）。核酸検出の 3 つの重要なステップから始めます。オンチップ サンプル前処理、核酸増幅、シグナル読み取りです。次に、さまざまな種類のマイクロ流体プラットフォームをその構造と機能と比較し、独自の特性 (長所と短所) を示しました。デジタル核酸検出についてさらに説明し、感染性病原体分子の絶対定量のための第 3 世代技術の例として示します。さらに、分子診断のためのマイクロ流体 POCT 市場の現状を示すために、いくつかの典型的および最新の商用 POCT デバイスが紹介されます。また、将来のアプリケーションに対するビジョンについても説明します。
核酸検出用のマイクロ流体チップのモジュールは、その機能に応じて 3 つのカテゴリ (サンプリング、認識、およびシグナル伝達) に分けることができます [19]。これらのモジュールのうち、サンプリングモジュールは、主にサンプルの溶解と核酸の抽出を実現します。センサーモジュールは、主に核酸シグナルの変換と増幅を制御します。シグナリング モジュールは、センシング モジュールによって変換および処理された信号を検出します。チップ上で核酸を検出するプロセスをもとに、「入出力」機能を実現できる各種チップについてまとめます。
核酸検出の最初のステップは、核酸抽出、つまり元のサンプルから標的核酸を分離することです。核酸抽出は、他の分子夾雑物から核酸を精製し、核酸分子の一次構造の完全性を確保し、結果を最適化するために行われます。核酸抽出には、必要なサンプル溶解と核酸捕捉が必要であり、その品質と効率は研究と診断結果に大きな影響を与えます。抽出中の微妙な副作用により、それ以上の検出が制限される場合があります。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) およびループ等温増幅 (LAMP) 法は、核酸分離試薬中のエタノールやイソプロパノールなどの残留有機溶媒によって阻害されます [20]。液液抽出と固相抽出は、核酸を分離するための最も一般的な方法です [21] が、液液抽出で使用される試薬がほとんどのマイクロ流体チップの腐食を引き起こすため、チップでの液液抽出は非常に限られています。 .ここでは、マイクロ アレイ ベースの固相抽出方法を強調し、それらの長所と短所を比較します。
シリコンは、その生体適合性、安定性、および修飾の容易さから、核酸と適合する基板材料です [22]。重要なことに、シリカまたは他の材料で修飾すると、この複合材料は、高 pH、低塩溶液で溶出しながら、低 pH、高塩条件下で負に帯電した核酸を吸着する特性を示します。この現象を利用して核酸を精製することができる。
シリカビーズ、粉末、マイクロファイバーフィルター、シリカメンブレンなど、さまざまな形態のシリカベースの材料がマイクロフルイディクスでの核酸抽出に使用されています [23、24、25、26]。材料の特性に応じて、シリコンベースの材料はさまざまな方法でマイクロ回路に使用できます。たとえば、シリカの顆粒、粉末、および市販のナノフィルターは、マイクロ流体チップの細孔またはマイクロチャネルに簡単に配置でき、サンプルからの核酸の抽出に役立ちます [27、28、29]。表面修飾シリカ膜は、低コストで病原体から DNA を迅速に精製するためにも使用できます。たとえば、王ら。[30] キトサンオリゴ糖でコーティングされたシリカ膜を用いたベシクル媒介鎖交換による変性増幅反応を組み合わせることにより、102〜108個のコロニー形成単位を首尾よく検出する汎用ポータブルシステムが導入されました。(CFU)/ml 腸炎ビブリオ。、ウイルスの存在が容易に確認できました。パウエル等。[31] 次に、シリコンベースのマイクロアレイを使用して、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ジカウイルス、およびヒトパピローマウイルスと自動増殖を検出し、RNAウイルスを捕捉するために1.3μlの曲がりくねったマイクロリアクターを開発しました。その場での増幅を実行します。これらの方法に加えて、修飾材料の形状と特性が抽出効率を大幅に向上させるため、表面修飾シリカマイクロカラムも核酸抽出において重要な役割を果たします。チェン等。[32] アミノ コーティング シリコン マイクロカラムに基づく低濃度 RNA の分離のためのマイクロ流体プラットフォームを提案しました。このマイクロ流体デバイスは、シリコン基板上に 0.25 cm2 マイクロピラーのアレイを統合し、高表面積対体積比設計により、より高い抽出効率を達成します。この設計の利点は、マイクロ流体デバイスが最大 95% の核酸抽出効率を達成できることです。これらのシリコンベースの戦略は、核酸を低コストで迅速に分離する価値を示しています。マイクロ流体チップと組み合わせて、シリコンベースの抽出戦略は、核酸検出の効率を高めるだけでなく、分析デバイスの小型化と統合も促進します[20]。
磁気分離法は、磁性粒子を使用して、外部磁場の存在下で核酸を分離します。一般的に使用される磁性粒子には、シリカ、アミノ、およびカルボキシルでコーティングされた Fe3O4 または γ-Fe2O3 磁性粒子が含まれます [33,34,35,36]。シリコンベースの SPE メソッドと比較した磁性粒子の際立った特徴は、外部磁石による操作と制御が容易なことです。
核酸とシリカの静電相互作用を利用して、高塩分・低pH条件下では核酸をシリカ被覆磁性粒子の表面に吸着させ、低塩分・高pH条件下では分子を洗浄することができます。また。.シリカでコーティングされた磁気ビーズは、磁気的に制御されたモーションを使用して大量のサンプル (400 μL) から DNA を抽出することを可能にします [37]。デモンストレーションとして、Rodriguez-Mateos et al。[38] 調整可能な磁石を使用して、異なるチャンバーへの磁気ビーズの移動を制御しました。シリカでコーティングされた磁性粒子に基づいて、470 コピー/mL の SARS-CoV-2 ゲノム RNA を廃水サンプルから抽出して、LAMP 逆転写検出 (RT-LAMP) を行うことができ、応答を 1 時間以内に読み取ることができます。肉眼（図2a）。
磁性および多孔質材料に基づくデバイス。SARS-CoV-2 RNA 検出用の IFAST RT-LAMP マイクロ流体デバイスの概念図 ([38] より転載)。b 口腔スワブ核酸の dSPE 用の遠心マイクロ デバイス ([39] から改変)。c FTA® カード ([50] から適合) を使用した組み込みの自己給電型サンプル濃縮器。d キトサンで修飾されたフュージョン 5 ろ紙 ([51] から改変)。SARS-CoV-2 重症急性呼吸器症候群 コロナウイルス 2、RT-LAMP 逆転写ループ媒介等温増幅、FTA ファインダー技術パートナー、NA 核酸
正に帯電した磁性粒子は、核酸のリン酸骨格を結合するのに理想的です。特定の塩濃度で、核酸の負に荷電したリン酸基は、磁性複合粒子の表面で正に荷電することができます。したがって、粗い表面と高密度のアミノ基を持つ磁性ナノ粒子が、核酸の抽出用に開発されました。磁気分離とブロッキングの後、磁性ナノ粒子と DNA 複合体は PCR で直接使用できるため、複雑で時間のかかる精製と溶出操作が不要になります [35]。負のカルボキシル基でコーティングされた磁性ナノ粒子は、高濃度ポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウム溶液の表面に吸着した核酸を分離するためにも使用されています [36]。これらの表面修飾された磁気ビーズを使用すると、DNA 抽出はその後の増幅と互換性があります。ディグナン等。[39] は、核酸前処理のための自動化されたポータブル遠心マイクロ流体プラットフォームを説明し、非技術者が現場で使用できるようにしました。さらに、ポイントオブケア核酸分析に適した方法であるLAMPとの単離されたDNAの適合性は、最小限の機器要件と比色アッセイへの適合性をさらに示しています（図2b）。
磁気ビーズ法は自動抽出の可能性を提供し、そのうちのいくつかは市販の自動核酸抽出器に存在する[KingFisher;ThermoFisher (米国マサチューセッツ州ウォルサム)、QIAcube® HT;CapitalBio (北京、中国) および Biomek®。ベックマン（マイアミ、米国）。)、フロリダ州、米国)]。磁気ビーズとマイクロフルイディクスを組み合わせることの利点は、核酸の効率的な自動抽出に使用でき、分子診断の開発を進める可能性があります。ただし、磁気ビーズとマイクロフルイディクスの組み合わせは、磁気ビーズの正確な操作のための複雑な制御システムに大きく依存しています。これは、POCT での磁気ビーズのさらなる適用を制限する、かさばって高価な市販製品の人気を説明しています。
修飾ニトロセルロースフィルター、Finders Technology Associates (FTA) カード、ポリエーテルスルホンベースの濾紙、およびグリカンコーティングされた材料などのいくつかの多孔性材料も、核酸検出に使用されています [40、41、42、43、44]。繊維紙などの多孔質繊維材料は、長鎖 DNA 分子を繊維と物理的に絡ませることによって DNA を分離するために最初に使用されました。細孔が小さいと、DNA 分子の強力な物理的制限が生じ、DNA 抽出にプラスの影響を与えます。繊維紙の孔径が異なるため、抽出効率は DNA 増幅のニーズを満たすことができません [45、46]。FTA カードは、法医学の分野で使用される市販の濾紙であり、分子診断の他の分野でも広く使用されています。さまざまな化学物質を含浸させたセルロースろ紙を使用してサンプルの細胞膜を溶解することにより、放出された DNA は最大 2 年間分解から保護されます。最近では、含浸セルロース紙が、SARS-CoV-2、リーシュマニア症、マラリアなどのさまざまな病原体の分子検出のために開発されました [47,48,49]。分離された血漿中の HIV は直接溶解され、ウイルス核酸は濃縮器に組み込まれた FTA® フロー膜で濃縮され、核酸の効率的な産生が可能になります [50] (図 2c)。FTAカードを使用した核酸検出の主な問題は、グアニジンやイソプロパノールなどの化学物質がその後の増幅反応を阻害することです。この問題を解決するために、我々はFusion 5キトサン修飾ろ紙を開発しました。これは、DNA分子と繊維状ろ紙の物理的な絡み合いと、キトサン修飾化合物へのDNAの静電吸着の両方の利点を組み合わせて、高効率の核酸抽出を実現します。 ..フィルター繊維 [51] (図 2d)。同様に、Zhu等。[52] は、ジカ ウイルス RNA の迅速な分離と検出のための in situ キャピラリー マイクロ流体システムに基づくキトサン修正 PCR 法を示しました。核酸は、キトサンのオン/オフスイッチ特性に基づいて、ライセート/PCR混合培地でそれぞれ吸着/脱着することができます。オンとオフ」、pH に反応します。
上記のように、これらの戦略は、さまざまな固相材料の利点を組み合わせて、マイクロ流体工学における核酸抽出の効率を高めます。実際の用途では、これらの材料を大量に使用することは不経済であり、これらの材料と共通の材料を適切に表面処理または表面改質することで、それらの機能を維持することもできます。したがって、パイロットスタディの後にこれらの戦略を実施することで、コストを削減できると考えられています。
マイクロ流体プラットフォームでの核酸検査では、少量のサンプル (< 100 µl) を使用することが多いため、下流の検出 (光学、電気、および磁気) に便利な信号に変換するために、特定のプローブを使用して標的核酸を増幅する必要があります [53, 54]。 マイクロ流体プラットフォームでの核酸検査では、少量のサンプル (< 100 µl) を使用することが多いため、下流の検出 (光学、電気、および磁気) に便利な信号に変換するために、特定のプローブを使用して標的核酸を増幅する必要があります [53, 54]。 При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. マイクロ流体プラットフォームで核酸をテストする場合、少量のサンプル (<100 μL) が使用されることが多いため、特別なプローブを使用してターゲット核酸を増幅し、その後の検出 (光学、電気、および磁気) に便利な信号に変換する必要があります。 [53、54]。マイクロフロー制御プラットフォームでの核酸検査では、通常、少量（< 100 µl）が使用されるため、特定のプローブを使用して目的標識の核酸を測定する必要があります。 ]。マイクロフロー制御平台の上の核酸は、少量の量（（<100 µl）を使用します。したがって、特定のプローブの目印が必要です。 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. マイクロ流体プラットフォームでの核酸の検出では、通常、少量のサンプル (<100 μl) を使用します。これには、特別なプローブを使用してターゲット核酸を増幅し、その後の検出 (光学、電気、および磁気) 用の信号に変換する必要があります [53, 54]] .マイクロフルイディクスにおける核酸増幅は、反応を高速化し、検出限界を最適化し、サンプル要件を減らし、検出精度を向上させることもできます [55, 56]。近年、迅速かつ正確な検出の実現に伴い、さまざまな核酸増幅方法が、PCR やいくつかの等温増幅反応を含むマイクロ流体工学に適用されています。このセクションでは、マイクロ流体システムに基づく核酸検出の方法をまとめます。
PCR は生物の DNA 複製プロセスのシミュレーションであり、その理論は他の場所で詳しく説明されているため、ここでは説明しません。PCR は非常に少量のターゲット DNA/RNA を指数関数的に増幅できるため、PCR は核酸を迅速に検出するための強力なツールとなります。ここ数十年で、ポイントオブケア診断のニーズを満たすために、PCRサーマルサイクリングシステムを備えた多くのポータブルマイクロ流体デバイスが開発されました[57、58]。オンチップ PCR は、異なる温度制御方法に従って、4 つのタイプ (従来型、連続フロー、空間的に切り替えられた、および対流 PCR) に分けることができます [59]。たとえば、ジーら。[60] 咽頭スワブサンプル中の SARS-CoV-2、インフルエンザ A および B ウイルスの多重検出のために、独自のマイクロ流体プラットフォームで直接逆転写定量的 PCR (RT-qPCR) 法を開発しました (図 3a) 。パーク等。[61] は、薄膜 PCR、電極、および指で操作するポリジメチルシロキサンベースのマイクロ流体モジュールを統合することにより、単純な病原体分析チップを構築しました。ただし、両方の作品は、従来の PCR の共通の欠点を具現化します。PCR にはサーマル サイクリングが必要なため、デバイスのさらなる小型化とテスト時間の短縮が制限されます。
この問題に対処するには、連続フロー ベースのマイクロ流体およびスペース スイッチ PCR の開発が重要です。長い曲がりくねったチャネルまたは短いストレート チャネルを使用して、連続フロー PCR は、オフチップ ポンプを使用して 3 つの予熱ゾーンで試薬を積極的に循環させることにより、高速増幅を提供できます。この操作は、異なる反応温度間の移行段階を首尾よく回避し、テスト時間を大幅に短縮します [62] (図 3b)。ユングらによる別の研究では。[63] 超高速および多重逆転写 PCR 用の固定およびフロー PCR の特性を組み合わせた新しいロータリー PCR 遺伝子分析装置を提案しました (図 3c)。核酸増幅の場合、PCR マイクロチップは、異なる温度で 3 つの加熱ブロックを通過します。1. 94°C の変性ブロック、2. 58°C のアニーリング ブロック、3. 72°C の拡張ブロック。
マイクロフルイディクスにおける PCR の応用。マイクロ流体プラットフォームでの dirRT-qPCR の模式図 ([60] から適応)。b 蛇行チャネルに基づく連続フロー PCR マイクロアレイの概略図 ([62] から改作)。cマイクロチップ、3つの加熱ブロック、およびステッパーモーターで構成される回転式PCR遺伝子分析装置の概略図（[63]から改変）。d 遠心分離およびセットアップを伴う熱対流 PCR の図 ([64] から改変)。DirRT-qPCR、直接定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
キャピラリーとループ、さらには薄いプレートを使用する対流 PCR では、外部ポンプを必要とせずに、自然な自由熱対流によって核酸を迅速に増幅できます。例えば、環状オレフィンポリマーのマイクロ流体プラットフォームは、PCR ループマイクロチャネルでの遠心分離によるサーマルサイクリングを使用する、製造された回転加熱ステージ上で開発されました [64] (図 3d)。反応溶液は熱対流によって駆動され、環状構造を持つマイクロチャネル内で高温と低温が連続的に交換されます。増幅プロセス全体は 10 分で完了し、検出限界は 70.5 pg/チャンネルです。
予想どおり、迅速な PCR は、完全に統合されたサンプル応答分子診断およびマルチプレックス分析システムの強力なツールです。ラピッド PCR は、SARS-CoV-2 の検出に必要な時間を大幅に短縮し、COVID-19 パンデミックの効果的な制御に貢献します。
PCR には、POCT には適していない複雑なサーマルサイクラーが必要です。最近では、LAMP、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 (RPA)、および核酸配列に基づく増幅を含むがこれらに限定されない等温増幅技術がマイクロフルイディクスに適用されています [65,66,67,68]。これらの技術により、核酸は一定の温度で増幅され、分子診断用の低コストで高感度のポータブル POCT デバイスの作成が容易になります。
高スループットのマイクロフルイディクス ベースの LAMP アッセイにより、感染症の複数の検出が可能になります [42、69、70、71]。遠心マイクロ流体システムと組み合わせることで、LAMP は核酸検出の自動化をさらに促進することができます [69, 72, 73, 74, 75]。スピン・アンド・リアクションのSlipChipは、LAMPを使用して複数の並行細菌を視覚的に検出するために開発されました[76]（図4a）。アッセイで最適化された LAMP を使用すると、蛍光シグナル対ノイズ比は約 5 倍になり、検出限界はゲノム DNA の 7.2 コピー/μl に達しました。 さらに、Bacillus cereus、Escherichia coli、Salmonella enterica、Vibriofluvialis、Vibrio parahaemolyticus を含む 5 つの一般的な消化性細菌病原体の存在が、この方法に基づいて 60 分未満で可視化されました。 さらに、Bacillus cereus、Escherichia coli、Salmonella enterica、Vibriofluvialis、Vibrio parahaemolyticus を含む 5 つの一般的な消化性細菌病原体の存在が、この方法に基づいて 60 分未満で可視化されました。さらに、バチルス・セレウス、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、ビブリオ・フルビアリス、ビブリオ・パラヘモリティカスを含む、消化管の5つの一般的な細菌性病原体の存在が、この方法を使用して60分以内に可視化されました。さらに、この方法に基づいて、60分未満で、5つの通常の消化管細菌病原体の存在を確認することができた.さらに、この方法に基づいて、5つの常在性消化管細菌病の存在が60分未満で観察された。アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 アーク菌 HIPさらに、バチルス・セレウス、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、ビブリオ・フルビウス、およびビブリオ・パラヘモリティカスを含む5つの一般的な胃腸病原体の存在が、この方法を使用して60分以内に可視化されました。
マイクロフルイディクスにおける LAMP の利点には、とりわけ、高速応答と小型化された検出が含まれます。ただし、反応温度（70℃前後）により、LAMP中にエアロゾルが発生することは避けられず、偽陽性率が高くなります。アッセイの特異性、プライマーの設計、および温度制御も、LAMP 用に最適化する必要があります。さらに、1 つのチップで複数のターゲット検出を実装するチップ設計は非常に価値があり、開発する必要があります。また、LAMP は 1 チップに統合された多目的検出に適しており、これは非常に重要ですが、まだ開発の余地がたくさんあります。
LAMP の高い偽陽性率は、比較的低い反応温度 (~37 °C) により蒸発の問題が比較的少ないため、RPA で部分的に減らすことができます [77]。RPA システムでは、2 つの反対のプライマーがリコンビナーゼに結合することによって DNA 合成を開始し、増幅は 10 分以内に完了することができます [78,79,80,81]。したがって、RPA プロセス全体は、PCR や LAMP よりもはるかに高速です。近年、マイクロ流体技術は、RPA の速度と精度をさらに向上させることが示されています [82,83,84]。たとえば、劉ら。[85]は、逆転写RPA（RT-RPA）とユニバーサルラテラルフローテストストリップ検出システムを統合することにより、SARS-CoV-2を迅速かつ高感度に検出するためのマイクロ流体統合ラテラルフローポリメラーゼリコンビナーゼ増幅アッセイを開発しました。単一のマイクロ流体システムに。図 4b)。検出限界は 1 コピー/μl または 30 コピー/サンプルで、約 30 分で検出が完了します。コングら。ウェアラブルなマイクロ流体デバイスを開発しました。[86] 体温と携帯電話ベースの蛍光検出システムを使用して、RPA を使用して HIV-1 DNA を迅速かつ直接検出しました (図 4c)。ウェアラブル RPA アッセイは、24 分以内に 100 コピー/mL のターゲット シーケンスを検出し、リソースが限られた環境で HIV-1 に感染した乳児を迅速に診断する大きな可能性を示しています。
ポイントオブケア検査 (POCT) における等温増幅。スピン・リアクションSlipChipの開発・製造。プラズマ溶接の後、上部と下部のチップを一連のナットで組み立てて、最終的なチップを形成しました ([76] から適合)。b COVID-19 検出のための MI-IF-RPA システムの概略図 ([85] から改変)。c HIV-1 DNA の迅速な検出のためのウェアラブル RPA テストの概略図 ([86] から改作)。SE Salmonella enterica、VF Vibriofluvius、VP Vibrio parahaemolyticus、BC Bacillus cereus、EC Escherichia coli、FAM carboxyfluorescein、ヒト免疫不全ウイルス HIV、RPA リコンビナーゼ ポリメラーゼ増幅、LED 発光ダイオード、MI-IF-RPA マイクロフルイディクス Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase増幅
マイクロ流体ベースの RPA は急速に発展していますが、チップ製造と反応消費のコストが高すぎるため、この技術の可用性を高めるために削減する必要があります。さらに、RPA の高感度は、特に汚染の存在下で、非特異的な産物の増幅に影響を与える可能性があります。これらの制限は、マイクロ流体システムにおける RPA の適用に影響を与え、さらなる最適化に値する可能性があります。POCT における RPA ベースのマイクロ流体戦略の実現可能性を向上させるには、さまざまなターゲットに対して適切に設計されたプライマーとプローブも必要です。
Cas13 と Cas12a は、核酸をランダムに切断する能力を持っているため、検出および診断ツールとして開発できます。Cas13 および Cas12a は、それぞれ標的 DNA または RNA に結合すると活性化されます。活性化されると、タンパク質は他の近くの核酸を切断し始め、その後、病原体特異的核酸を標的とするガイド RNA がクエンチされた蛍光プローブを切断し、蛍光を放出します。この理論に基づいて、ケルナー等。[87] は、Cas13 ベースの方法 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] を開発し、Broughton et al.[88] Cas12a に基づく別のアプローチを開発した [CRISPR Trans Reporter ターゲティング DNA エンドヌクレアーゼ (DTECR)]。
近年、CRISPR に基づく核酸の検出のためのさまざまな方法が登場しています [89, 90]。従来の CRISPR ベースの方法は、核酸抽出、増幅、CRISPR 検出などの複数の手順により、多くの場合、時間と労力がかかります。液体を空気にさらすと、偽陽性の結果が出る可能性が高くなる可能性があります。以上のことから、CRISPR ベースのシステムには最適化が切実に必要です。
CRISPR-Cas12a および CRISPR-Cas13a 検出アプリケーション用に、24 の分析を並行して実行できる空気圧制御のマイクロ流体プラットフォームが開発されました [91]。このシステムには、核酸増幅をバイパスし、フェムトモル DNA および RNA サンプルを自動的に検出する蛍光検出デバイスが装備されています。チェン等。[92] 遠心マイクロフルイディクスにおける CRISPR-Cas12a システムによるリコンビナーゼ増幅の統合 (図 5a)。この作業は、Cas12a がメッセンジャー DNA を消化し、増幅プロセスを阻害できるため、これら 2 つのプロセスを統合することの難しさを克服します。さらに、チェン等。[92] さらに、反応試薬を遠心マイクロ流体制御に事前保存して、プロセス全体を自動的に完了させました。別の作品では、Silva 等。[93] は、CRISPR/Cas12a 増幅のない診断方法と、SARS-CoV-2 を検出するためのスマートフォンを開発しました (図 5b)。携帯電話ベースの無増幅システムとして知られるこのアッセイには、マイクロ流体チャネルでのカタラーゼ生成バブル信号のスマートフォンによる可視化に基づく CRISPR/Cas 依存性酵素が含まれています。プレ増幅なしで 50 コピー/μl 未満の核酸を高感度で検出。サンプル注入からシグナル読み取りまでの全プロセスにかかる時間はわずか 71 分です。
CRISPRに基づく核酸検出法。CRISPR に基づく統合分子診断のための遠心 POCT ([92] から適応)。b SARS-CoV-2 のスマートフォンベースの分析のための CASCADE テストの開発 ([93] から適応)。RAA リコンビナーゼ増幅、PAM 隣接プロトスペーサー モチーフ、CRISPR クラスター化された一定間隔での短い回文反復、CRISPR/CAS 依存酵素による携帯電話増幅のない CASCADE システム、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩 EDC
核酸検出の最後のステップとして、シグナル検出は診断結果を直接反映し、効率的で高感度で正確な POCT の開発における重要な要素です。シグナルは、蛍光法、電気化学法、比色法、磁気法などのさまざまな方法を使用して読み取ることができます。このセクションでは、各アプローチの理論的根拠を説明し、マイクロ流体工学における感染症の分子診断を比較します。
蛍光ベースの戦略は、優れた感度、低コスト、操作の容易さ、およびポイントオブケア分析という顕著な利点により、感染症の POCT 診断に広く使用されています [94、95]。これらの戦略では、蛍光色素やナノ材料などの標識蛍光体を使用して、検出可能なシグナル (蛍光増強または消光) を生成します。この発見は、蛍光ベースの戦略が、直接蛍光標識、シグナルオン、およびシグナルオフ蛍光検出に分けられることを示唆しています [96]。直接蛍光標識検出では、特殊な蛍光標識を使用して、ターゲットに選択的に結合したときに特定量の蛍光を生成する特定のリガンドを標識します。シグナルベースの蛍光検出の場合、蛍光シグナルの品質は対象の大きさに正の相関があります。蛍光強度は、ターゲットが存在しない場合は無視でき、十分な量のターゲットが存在する場合に検出可能です。逆に、「シグナルオフ」蛍光によって検出される蛍光の強度は、ターゲットの量に反比例し、最初は最大値に達し、ターゲットが大きくなるにつれて徐々に減少します。たとえば、CRISPR-Cas13a 標的依存性トランス切断メカニズムを使用して、Tian et al.[97] 逆転写を直接バイパスする RNA を検出するための新しい認識戦略を開発した (図 6a)。相補的なターゲット RNA に結合すると、CRISPR-Cas13-RNA 複合体が活性化され、非特異的なレポーター RNA による側副切断が引き起こされます。蛍光標識されたレポーター [フルオロフォア (F)] は、クエンチャー (Q) によって完全に消光され、活性化された複合体によって切断されると蛍光を発します。
電気化学的検出の利点は、検出速度が速く、製造が簡単で、コストが低く、持ち運びが簡単で、自動制御できることです。これは、POCT アプリケーションの強力な分析方法です。グラフェン電界効果トランジスタに基づく Gao et al.[98] ボレリア・ブルグドルフェリ菌由来のライム病抗原を検出限界 2 pg/mL で多重検出するためのナノバイオセンサーを開発した (図 6b)。
比色アッセイは、携帯性、低コスト、準備の容易さ、および視覚的な読み取りの利点から恩恵を受けて、POCT アプリケーションで使用されています。比色検出では、ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ様ナノ材料の酸化、ナノ材料の凝集、および指示色素の追加を使用して、標的核酸の存在に関する情報を目に見える色の変化に変換できます [99、100、101]。特に、金ナノ粒子は比色戦略の開発に広く使用されており、迅速かつ重要な色の変化を誘発する能力があるため、感染症の in situ 診断のための POCT 比色プラットフォームの開発への関心が高まっています [102]。統合された遠心マイクロ流体デバイス [103] を使用すると、汚染された牛乳サンプル中の食品媒介病原体を 10 個の細菌細胞のレベルで自動的に検出でき、結果を 65 分以内に視覚的に読み取ることができます (図 6c)。
磁気センシング技術は、磁性材料を使用して検体を正確に検出でき、ここ数十年でPOCTアプリケーションに大きな関心が寄せられています。磁気センシング技術には、高価な光学部品ではなく低コストの磁性材料など、独自の利点があります。ただし、磁場を使用すると、検出効率が向上し、サンプル準備時間が短縮されます [104]。さらに、磁気プロービングの結果は、生物学的サンプルのわずかな磁気バックグラウンド信号による高い特異性、感度、および高い信号対雑音比を示しています [105]。シャルマ等。ポータブル マイクロ チップ プラットフォームに磁気トンネル接合ベースのバイオ センサーを統合しました。[106] 病原体のマルチプレックス検出用 (図 6d)。バイオ センサーは、病原体から分離されたサブナノモルの核酸を高感度で検出します。
典型的な信号検出方法。Cas13a のハイパーローカライズされた検出の概念 ([97] から適応)。b ライム GroES scFv と組み合わせたグラフェンナノバイオセンサー FET ([98] から適応)。c 遠心マイクロ流体チップにおける食品由来病原体のマルチプレックス検出の比色表示: 標的病原体を含む No. 1 および No. 3 サンプル、および標的病原体を含まない No. 2、No. 4 および No. 5 サンプル ([103] から適合) .d 磁気トンネル接合に基づくバイオセンサー。プラットフォーム、内蔵ブロッキング増幅器、制御ユニット、および信号生成/取得用の電源が含まれます ([106] から適合)。GFET グラフェン FET、大腸菌、大腸菌、ネズミチフス菌、腸炎ビブリオ、腸炎ビブリオ、リステリア菌、PC PC、PDMS ジメチコン、PMMA ポリメチルメタクリレート
上記の検出方法の優れた特徴にもかかわらず、それらにはまだ欠点があります。これらの方法を比較し (表 1)、いくつかのアプリケーションと詳細 (長所と短所) を示します。
マイクロ流体工学、微小電気機械システム、ナノテクノロジー、および材料科学の発展に伴い、感染症の検出のためのマイクロ流体チップの使用は常に進歩しています [55,96,107,108]。小型機器と流体の正確な操作は、診断の精度と費用対効果に貢献します。したがって、さらなる開発のために、チップを最適化およびアップグレードするための努力がなされており、その結果、さまざまな構造と機能を持つさまざまなマイクロ流体チップが生まれました。ここでは、いくつかの一般的なタイプのマイクロ流体プラットフォームを簡単に紹介し、それらの特性 (長所と短所) を比較します。さらに、以下に挙げる例のほとんどは、主に SARS-CoV-2 との闘いに焦点を当てています。
LOCC は、最も一般的な小型化された複雑な分析システムであり、その操作は、サンプルの注入と準備、フロー制御、液体検出から、高度に小型化、統合、自動化、並列化されています [109, 110]。液体は、慎重に設計されたジオメトリと、圧力勾配、毛細管現象、電気力学、磁場、音響波などの多くの物理的効果の相互作用によって操作されます [111]。LOCC は、分析速度が速く、サンプル サイズが小さく、消費電力が少なく、管理と運用の効率が高いため、ハイスループット スクリーニングと複数の検出に優れた利点を示します。ただし、LOCC デバイスは非常にデリケートで、製造、パッケージング、およびインターフェイスです。しかし、多重化と再利用は大きな困難に直面している[96]。他のプラットフォームと比較して、LOCC には最大のアプリケーションの多様性と最高の技術互換性という点で独自の利点がありますが、その欠点も明らかです。つまり、複雑さが高く、再現性が低いということです。多くの場合、かさばって高価な外部ポンプへの依存は、POCT での使用をさらに制限します。
COVID-19 の発生中、LOCC は多くの注目を集めました。同時に、いくつかのテクノロジーを組み合わせた新しいチップがいくつかあります。たとえば、スマートフォンは現在、ポータブル分析デバイスとして広く使用されており、LOCC 統合の大きな可能性を秘めています。サン等。[21] LAMPを使用して、SARS-CoV-2を含む5つの病原体の特定の核酸配列を多重化できるマイクロ流体チップを製造し、反応終了後1時間以内にスマートフォンを使用してそれらを分析しました。別の例として、Sundah et al。[112] は、スマートフォンを使用して SARS-CoV-2 RNA ターゲットを直接かつ高感度に検出するための分子スイッチ [分子遷移状態スイッチ (CATCH) による触媒的増幅] を作成しました。 CATCH はポータブル LOCC と互換性があり、優れた性能を達成します (約 8 RNA コピー/μl; 室温で < 1 時間) [112]。 CATCH はポータブル LOCC と互換性があり、優れた性能を達成します (約 8 RNA コピー/μl; 室温で < 1 時間) [112]。 CATCH は、LOCC と LOCC の両方で使用されます。 CATCH はポータブル LOCC と互換性があり、優れたスループットを提供します (約 8 RNA コピー/μl; 室温で < 1 時間) [112]。 CATCH は、携帯型 LOCC と互換性があり、優れた性能を備えています（約 8 RNA/μl、室温で 1 時間未満）[112]。 CATCH は、携帯型 LOCC と互換性があり、優れた性能を備えています（約 8 RNA/μl、室温で 1 時間未満）[112]。 CATCH は、LOCC と обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатурое1при комнатнет.1 примерной) CATCH はポータブル LOCC と互換性があり、優れた性能を発揮します (約 8 RNA コピー/μl; 室温で 1 時間未満) [112]。さらに、分子診断用のLOCCデバイスは、真空、ストレッチ、電場などの駆動力も使用します。カンら。[113] は、真空プラズモニック液体 PCR チップを使用して、現場で COVID-19 を迅速かつ定量的に診断するためのリアルタイムの超高速ナノプラズマオンチップ PCR を実証しました。李等。[114] その後、COVID-19 の診断を可能にするストレッチ駆動のマイクロ流体チップを開発した。このプラットフォームは、RT-LAMP 増幅システムを使用して、サンプルが定性的に陽性か陰性かを判断します。その後、ラマチャンドラン等。[115] は、マイクロフルイディクスに実装された選択的イオン集束技術である等速電気泳動 (ITP) を使用して、適切な電界勾配を達成しました。ITP を使用すると、未加工の鼻咽頭スワブ サンプルからターゲット RNA を自動的に精製できます。それからラマチャンドラン等。[115] この ITP 精製を ITP 増強 LAMP および CRISPR アッセイと組み合わせることで、約 35 分でヒト鼻咽頭スワブおよび臨床検体から SARS-CoV-2 が検出されました。さらに、新しいアイデアは常に生まれています。Jadhav等。[116] は、表面増強ラマン分光法に基づく診断スキームを、垂直方向に配向した金/銀コーティング カーボン ナノチューブまたは使い捨てのエレクトロスピニング マイクロ/ナノチューブのいずれかを含むマイクロ流体デバイスと組み合わせて提案しました。膜機能内蔵フィルター マイクロ チャネルは使い捨てです。唾液、鼻咽頭、涙液など様々な体液・滲出液からウイルスを吸着します。したがって、ウイルス力価が豊富で、ラマン シグネチャによってウイルスを正確に識別することができます。
LOAD は、すべてのプロセスが微細構造基板を回転させる周波数プロトコルによって制御される遠心マイクロ流体プラットフォームです [110]。LOAD装置は、遠心力を重要な駆動力として利用しているのが特徴です。液体は、毛細管力、オイラー力、コリオリ力も受けます。遠心分離機を使用して、放射状の内側から外側への連続的な液体操作で分析が実行されるため、追加の外部チューブ、ポンプ、アクチュエータ、およびアクティブ バルブが不要になります。つまり、単一の制御方法で操作が簡単になります。負荷中心から同じ距離にある同じマイクロ流体チャネル内の液体に作用する力は等しく、チャネル構造を繰り返すことができます。したがって、LOAD 装置は、従来の LOCC 装置よりも設計と製造が簡単で経済的ですが、反応はほとんど独立しており、並列化されています。ただし、遠心分離装置の機械的強度が高いため、利用できるチップ材料は限られており、少量は困難です。車に。同時に、ほとんどの LOAD デバイスは 1 回だけ使用するように設計されており、大規模な検出には費用がかかります [96、117、118、119]。
ここ数十年で、最も有望なマイクロ流体デバイスの 1 つと考えられている LOAD は、研究者やメーカーからかなりの注目を集めてきました。したがって、LOAD は広く受け入れられ、感染性病原体の分子診断に使用されており [120、121、122、123、124]、特に COVID-19 の発生時に使用されています。たとえば、2020 年末に、Ji ら。[60] は、咽頭スワブ標本における SARS-CoV-2 およびインフルエンザ A および B 感染の迅速かつ自動化された並行検出のための直接 RT-qPCR アッセイを示しました。それからXiong等。[74] SARS-CoV-2 を含む 7 つのヒト呼吸器コロナウイルスを 40 分以内に迅速かつ正確に同時に検出するための、LAMP 統合された円盤状マイクロ流体プラットフォームを発表しました。2021 年初頭、de Oliveira 等。[73] は、COVID-19 の RT-LAMP 分子診断のために、指先回転子で手動操作するポリスチレン トナー遠心マイクロ流体チップを実証しました。その後、ディグナン等。[39] は、口腔スワブ切片から直接 SARS-CoV-2 RNA を精製するための自動化されたポータブル遠心マイクロデバイスを発表しました。メドベドら。[53] は、検出限界が 10 コピー/μL、最小サイクル閾値が 15 分の少量の回転式マイクロ流体蛍光チップを備えたインライン SARS-CoV-2 エアロゾル サンプリング システムを提案しました。スアレス等。[75] 最近、LAMP を使用して、熱不活化鼻咽頭スワブサンプル中の SARS-CoV-2 RNA を直接検出するための、統合されたモジュラー遠心マイクロ流体プラットフォームの開発が報告されました。これらの例は、COVID-19 の分子診断における LOAD の大きな利点と可能性を示しています。
1945 年、Muller と Clegg [125] は、ろ紙とパラフィンを使用した紙上のマイクロ流体チャネルを初めて発表しました。2007 年、Whitesides グループ [126] は、タンパク質とブドウ糖の検査のための最初の機能紙プラットフォームを作成しました。紙は、マイクロフルイディクスの理想的な基板となっています。この紙は、親水性と多孔質構造、優れた生体適合性、軽量、柔軟性、折り畳み性、低コスト、使いやすさ、利便性などの固有の特性を備えています。従来の µPAD は、紙の基板上に構築された親水性/疎水性構造で構成されています。三次元構造に応じて、μPAD は二次元 (2D) と三次元 (3D) μPAD に分けることができます。2D µPAD は疎水性境界を形成してマイクロ流体チャネルを形成することによって生成されますが、3D µPAD は通常、2D マイクロ流体紙の層のスタックから作られ、時には紙の折り畳み、スリップ技術、オープンチャネル、および 3D 印刷によって作成されます [96]。μPAD 上の水性または生体液は、主に外部電源なしで毛細管力によって制御されるため、試薬の事前保存、サンプル処理、マルチプレックス検出が容易になります。ただし、正確なフロー制御と多重検出は、不十分な検出速度、感度、および再利用性によって妨げられています [96、127、128、129、130]。
珍しいマイクロ流体プラットフォームとして、μPAD は、HCV、HIV、SARS-CoV-2 などの感染症の分子診断のために広く推進され、開発されてきた [131, 132]。HCVの選択的かつ高感度な検出のために、Tengam et al。[133] は、ピロリジニルペプチドに基づく高度に特異的な核酸プローブを使用して、蛍光紙に基づく新しいバイオセンサーを開発しました。核酸は、アミノ基とアルデヒド基の間の還元的アルキル化によって部分的に酸化されたセルロース紙に共有結合で固定され、検出は蛍光に基づいています。これらの信号は、携帯電話のカメラと組み合わせたポータブル蛍光カメラを備えた特別に作られたガジェットで読み取ることができます。続いて、Lu等。[134] DNAレドックスインジケーターとしてメチレンブルーを使用したDNAハイブリダイゼーションによるHIVターゲット検出用に、ニッケル/金ナノ粒子/カーボンナノチューブ/ポリビニルアルコール有機金属フレームワーク複合材料に基づく紙ベースの柔軟な電極を設計しました。最近では、Chowdury 等。[135] は、生の患者の唾液を LAMP と組み合わせて使用し、COVID-19 検体検出のためのポータブル イメージング技術を使用するポイント オブ ケア µPAD テストのための仮想プラットフォーム設計を提示しました。
ラテラル フロー テストでは、毛細管力によって流体を誘導し、多孔質または微細構造の基板の濡れ性と特性によって流体の動きを制御します。ラテラル フロー デバイスは、サンプル、コンジュゲート、インキュベーターと検出、および吸収パッドで構成されます。LFA の核酸分子は、結合部位にあらかじめ保存されている特定のバインダーを認識し、複合体として結合します。液体がインキュベーションプレートと検出プレートを通過すると、テストラインとコントロールラインにある捕捉分子によって複合体が捕捉され、肉眼で直接読み取ることができる結果が示されます。通常、LFA は 2 ～ 15 分で完了することができ、これは従来の検出よりも高速です。LFA は特殊な機構により、操作が少なく、追加の機器も必要ないため、非常に使いやすいです。製造と小型化が容易で、紙ベースの基板のコストが低くなります。しかし、それは定性的分析にのみ使用され、定量的検出は非常に困難であり、多重化能力とスループットは非常に制限されており、一度に 1 つの十分な核酸しか検出できません [96,110,127]。
LFA のほとんどのアプリケーションはイムノアッセイに焦点を当てていますが、マイクロ流体チップでの分子診断への LFA の使用も効果的で一般的です [136]。B型肝炎ウイルスの場合、HIVとSARS-CoV-2 LFA Gong et al。[137] アップコンバージョンナノ粒子 LFA プラットフォームを提案し、HBV 核酸などの複数のターゲットの高感度で定量的な検出を通じて、この小型化されたポータブルプラットフォームの汎用性を実証しました。さらに、フー等。[138] 低濃度での HIV-1 DNA の定量分析のための表面増強ラマン分光法に基づく新しい LFA を実証しました。SARS-CoV-2 の迅速かつ高感度な検出のために、Liu ら。[85] は、RT-RPA とユニバーサル側方流動検出システムを単一のマイクロ流体システムに組み合わせることにより、マイクロ流体統合型 RPA 側方流動分析を開発しました。
さまざまなマイクロ流体プラットフォームのアプリケーションは、プラットフォームの機能と利点を最大限に活用して、特定の研究によって異なります。手頃な価格のバルブ、ポンプ、ダクトを備えた LOCC は、アプリケーションの多様性と相互運用性を実現する最も包括的なプラットフォームであり、開発の余地が最大です。したがって、最新の研究が最初の試みとして LOCC で実施され、条件が最適化されることを希望し、推奨します。さらに、より効率的で正確な方法が発見され、システムで使用されることが期待されます。LOAD は、既存の LOCC デバイスからの流体の正確な制御に優れており、外部ドライブを必要とせずに遠心力による単一ドライブで独自の利点を示し、並列応答を分離して同期させることができます。したがって、将来的には、LOAD は、手動操作が少なく、より成熟した自動化された技術を備えた主要なマイクロ流体プラットフォームになるでしょう。µPAD プラットフォームは、LOCC と紙ベースの材料の利点を組み合わせて、低コストで使い捨ての診断を実現します。したがって、今後の開発は、便利で確立された技術に焦点を当てる必要があります。さらに、LFA は肉眼での検出に適しており、サンプルの消費を減らし、検出を高速化することが期待されます。詳細なプラットフォームの比較を表 2 に示します。
デジタル分析では、サンプルを多数のマイクロリアクターに分割し、それぞれのマイクロリアクターには個別の数の標的分子が含まれています [139, 140]。デジタルアッセイは、何千もの並行生化学実験を連続フェーズではなくミクロンスケールのコンパートメントで同時に個別に実行することにより、絶対定量を実行するための大きな利点を提供します。従来のマイクロフルイディクスと比較して、コンパートメント反応はサンプル量を減らし、反応効率を高め、チャンネル、ポンプ、バルブ、およびコンパクトな設計を必要とせずに他の分析方法と簡単に統合できます [141、142、143、144、145、146、 147]。次の 2 つの方法は、細胞、核酸、その他の粒子や分子などの試薬やサンプルを含む溶液の均一かつ正確な分離を達成するために、デジタル アッセイで使用されます。(2) デバイスの幾何学的制約によって配列分割が行われる。最初の方法では、マイクロチャネル内の試薬とサンプルを含む液滴は、並流、クロスフロー、フローフォーカシング、段階的乳化、マイクロチャネル乳化、および粘性せん断力とチャネル変化による乳化による膜などの受動的な方法によって作成できます。ローカリゼーション [143, 145, 146, 148, 149] またはアクティブな方法 [150, 151] を使用して、電気的、磁気的、熱的、および機械的制御によって追加のエネルギーを導入します。後者のアプローチでは、マイクロ流体チャンバー内の最適な流体体積の均一性は、マイクロピットや表面アレイなどの同じサイズの空間構造を維持することによって共有されます [152,153,154]。特に、液滴は、デジタル マイクロフルイディクス (DMF) に基づく電極アレイ上で生成および操作することもできる主要なフロー セクションです。誘電体のエレクトロウェッティングは、最もよく研究されている DMF 理論の 1 つです。誘電体のエレクトロウェッティングにより、個々の液滴を正確に操作し、液体の形状を制御し、異なる側面を通過する非対称電気信号を制御できるからです [141, 144]。DMF における液滴の主な操作には、ソート、分割、マージ [151, 155, 156] があり、さまざまな分析分野、特に分子検出 [157, 158, 159] に適用できます。
デジタル核酸検出は、従来の PCR および定量的リアルタイム PCR (qPCR) に続く第 3 世代の分子診断技術であり、ハイスループット シーケンスおよびリキッドバイオプシーと並行しています。過去 20 年間で、感染性病原体の分子診断の分野でデジタル核酸が急速に発展しました [160、161、162]。デジタル核酸検出の絶対定量化は、サンプルと試薬を個々のコンパートメントに詰めて、各ターゲット配列が各コンパートメントに入る確率が同じであることを確認することから始まります。理論的には、各セクションに複数のターゲット配列が割り当てられているか、独立したマイクロ反応システムが存在しない可能性があります。上記のさまざまな検知メカニズムを通じて、特定のしきい値を超えるシグナルを生成する微生物標的配列を含むコンパートメントは、肉眼または機械で視覚化でき、陽性としてラベル付けされますが、しきい値未満のシグナルを生成する他のコンパートメントは陽性としてラベル付けされます.各セクションの信号をブール値にする負のもの。したがって、作成されたコンパートメントの数と反応後の陽性結果の割合を計算することにより、標準曲線を必要とせずに、ポアソン分布式を使用してテスト サンプルの元のコピーを一致させることができます。 qPCRとして。[163] 従来の分子診断法と比較して、デジタル核酸検出は、自動化の度合いが高く、分析速度と感度が高く、試薬が少なく、汚染が少なく、設計と製造が簡単です。これらの理由から、SARS-CoV-2 の重大な流行中に、増幅とシグナル読み出し技術を組み合わせた分子診断のためのデジタルアッセイ、特にドロップベースの方法の使用がよく研究されてきました。たとえば、Yin et al。[164] 液滴デジタルと高速 PCR 法を組み合わせて、マイクロ流体チップで SARS-CoV-2 の ORF1ab、N、および RNase P 遺伝子を検出した。特に、このシステムは 115 秒以内に陽性シグナルを識別することができました。これは、従来の PCR よりも高速であり、ポイントオブケア検出におけるその有効性を示しています (図 7a)。ドンら。[165]、ソウら。[157]、チェンら。[166] と Alteri ら。[167] はまた、液滴デジタル PCR (ddPCR) を適用して、マイクロ流体システムで SARS-CoV-2 を検出し、印象的な結果を得ました。検出率をさらに改善するために、Shen et al。[168] は、画像スティッチング技術を使用せずにわずか 15 秒で ddPCR ベースのチップ イメージングを達成し、ラボからアプリケーションまでの ddPCR 技術プロセスを高速化しました。PCR などの熱増幅法だけでなく、等温増幅法を用いて反応条件を簡素化し、応答を高速化します。ルーら。[71] は、さまざまなサイズの液滴を高密度で 1 ステップで生成し、デジタル LAMP を使用して SARS-CoV-2 核酸を定量化できる、液滴分析用の SlipChip を開発しました (図 7b)。急速に進化する技術として、CRISPR は、追加の核酸染色を必要としない便利な比色イメージングにより、デジタル核酸検出においても重要な役割を果たすことができます。アッカーマン等。核酸の多重評価のための組み合わせマトリックス反応を開発しました。[158] マイクロウェルアッセイで、CRISPR-Cas13 ベースの核酸検出試薬を含む液滴で、SARS-CoV-2 を含む 169 のヒト関連ウイルスを検出しました (図 7c)。さらに、等温増幅と CRISPR テクノロジーを同じシステムで使用して、両方の利点を組み合わせることができます。パーク等。[169] CRISPR/Cas12a デジタルアッセイは、より短時間でより高いシグナル対バックグラウンド検出を備えたシングルステージ RT-RPA に基づいて、抽出および加熱殺菌された SARS-CoV-2 の検出のために市販のマイクロ流体チップで開発されました。時間比率。、より広いダイナミックレンジとより良い感度（図7d）。これらの例のいくつかの説明を表 3 に示します。
核酸検出のための典型的なデジタルプラットフォーム。a ラピッド デジタル PCR ワークフローは、4 つの重要なステップで構成されています。サンプルの調製、反応混合物の分配、増幅プロセス、およびターゲットの定量化です ([164] から改変)。b高密度での液滴形成のためのSlipChip液滴の分析を示す概略図（[71]から改作）。c CARMEN-Cas ワークフロー図13 ([158] から改作)。d ワンポットで CRISPR/Cas を使用した高度なデジタル ウイルス検出の概要 ([169] より転載)。W/O 油中水、ポリジメチルシロキサン PDMS、PCR ポリメラーゼ連鎖反応、DAQ データ収集、PID 比例積分微分、多重核酸評価のための CARMEN コンビナトリアル マトリックス反応、SARS-CoV-2、重症急性呼吸器症候群、コロナウイルス 2、逆転写酵素リコンビナーゼポリメラーゼ-RPAのRT増幅、バックグラウンドでのS/Bシグナル
投稿時間: Sep-15-2022
