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活性化エステルまたはフェノキシラジカルに基づく酵素近接標識法は、生細胞内の細胞内プロテオームおよびタンパク質相互作用因子をマッピングするために広く使用されています。ただし、活性化エステルは反応性が低いため、標識半径が広くなり、過酸化物処理によって生成されたフェノキシラジカルが酸化還元経路を妨害する可能性があります。ここでは、miniSOG 光増感剤タンパク質を目的のタンパク質に遺伝的にリンクすることによって開発された近接標識依存性光活性化 (PDPL) メソッドを報告します。青色光によってトリガーされ、露出時間によって制御される一重項酸素が生成され、アニリン プローブによるヒスチジン残基の時空間的に分解された標識が達成されます。オルガネラ固有のプロテオーム マッピングを通じて、その忠実度の高さを実証します。PDPL と TurboID を並べて比較すると、PDPL のより具体的かつ包括的なプロテオミクス カバレッジが示されます。次に、PDPL を疾患関連転写コアクチベーター BRD4 および E3 パーキン リガーゼに適用し、これまで知られていなかった相互作用因子を発見しました。過剰発現スクリーニングにより、2 つの未知の基質、Ssu72 および SNW1 が、ユビキチン化-プロテアソーム経路によって分解されるパーキンについて同定されました。
タンパク質ネットワークの正確な特性評価は、多くの基本的な細胞プロセスの根底にあります。したがって、タンパク質相互作用の非常に正確な時空間マッピングは、生物学的経路、疾患の病理を解読し、治療目的でこれらの相互作用を破壊するための分子基盤を提供します。この目的のために、生細胞または組織における時間的相互作用を検出できる方法が非常に望ましい。アフィニティ精製質量分析 (AP-MS) は、歴史的に目的のタンパク質 (POI) の結合パートナーを特定するために使用されてきました。定量的プロテオミクス手法の開発により、AP-MS に基づくタンパク質ネットワークの最大のデータベースである Bioplex3.0 が作成されました。AP-MS は非常に強力ですが、ワークフローの細胞溶解および希釈ステップは、弱くて一時的な結合相互作用に偏っており、溶解前に区画化されていない偽の相互作用ペアなどの溶解後のアーティファクトを導入します。
これらの問題に対処するために、架橋基を持つ非天然アミノ酸 (UAA) と酵素近傍標識 (PL) プラットフォーム (APEX や BioID など)5 が開発されました。UAA メソッドは多くのシナリオで正常に適用され、直接タンパク質接着剤に関する情報を提供しますが、UAA 挿入部位の最適化はまだ必要です。さらに重要なことに、それは標識イベントの触媒的逆転を欠く化学量論的標識法です。対照的に、BioID法などの酵素的PL法は、操作されたビオチンリガーゼをPOI7に融合させ、その後ビオチンを活性化して反応性のビオチン-AMPエステル中間体を形成します。したがって、この酵素は、近位のリジン残基を標識する活性化されたビオチン「クラウド」を触媒して放出します。ただし、BioID では、十分な標識信号を取得するのに 12 時間以上かかるため、時間分解能での使用はできません。酵母ディスプレイに基づく定向進化を使用して、TurboID は BioID に基づいてより効率的に設計され、10 分以内にビオチンで効率的に標識できるようになり、より動的なプロセスを研究できるようになりました。TurboID は非常に活性が高く、内因性ビオチン レベルは低レベルの標識に十分であるため、外因性ビオチンの添加によって高度に強化された時限標識が必要な場合、バックグラウンド標識が潜在的な問題になります。さらに、活性化エステルは反応性が低く (t1/2 ～ 5 分)、特にビオチン 5 で隣接タンパク質を飽和させた後では、大きな標識半径につながる可能性があります。 APEX は、細胞内プロテオーム、膜タンパク質複合体、細胞質シグナル伝達タンパク質複合体を同定するために広く使用されています11,12.しかし、高濃度の過酸化物の必要性は、酸化還元タンパク質または経路に影響を与え、細胞プロセス。
したがって、細胞経路を大幅に混乱させることなく、より反応性の高い標識半径抑制種を高い空間的および時間的精度で生成できる新しい方法は、既存の方法に重要な追加となります。 反応種の中で、一重項酸素は寿命が短く、拡散半径が限られているため (細胞内で t1/2 < 0.6 μs)、注目を集めました 13。 反応種の中で、一重項酸素は寿命が短く、拡散半径が限られているため (細胞内で t1/2 < 0.6 μs)、注目を集めました 13。 Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. 活性型の中で、一重項酸素は寿命が短く、拡散半径が限られているため (細胞内で t1/2 < 0.6 μs)、注目を集めました 13。活性物質では、単線式酸素はその寿命が短く、散乱半径が限られているため (細胞内の t1/2 < 0.6 μs)、注意が必要です 13。 1/2 < 0.6 µs）ながら我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). 活性型の中で、一重項酸素は寿命が短く、拡散半径が限られているため (細胞内で t1/2 < 0.6 μs)、注目を集めています。一重項酸素は、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、およびトリプトファンをランダムに酸化し、アミンまたはチオールベースのプローブへの結合のために極性 14,15 にすることが報告されています 16,17。一重項酸素は細胞内コンパートメント RNA のラベル付けに使用されていますが、内因性 POI 近接マーカーを転用するための戦略は未踏のままです。ここでは、光活性化依存近接標識 (PDPL) と呼ばれるプラットフォームを紹介します。ここでは、青色光を使用して miniSOG 光増感剤と融合した POI を照らし、一重項酸素生成をトリガーして近位残基を酸化し、続いてアミン含有修飾を行って化学プローブを酸化します。中間生細胞。.タグの特異性を最大化するために化学プローブのグループをテストし、オープンなプロテオミクス ワークフローを使用して修飾部位を特定しました。PDPL と TurboID を並べて比較すると、PDPL のより具体的かつ包括的なプロテオミクス カバレッジが示されます。このアプローチを、細胞内プロテオームのオルガネラ特異的マーカーと、癌関連エピジェネティック調節タンパク質BRD4およびパーキンソン病関連E3リガーゼParkinの結合パートナーの一般的なプロテオーム同定に適用し、既知および未知のタンパク質ネットワークの両方を確認しました。相互作用。.PDPL が大きなタンパク質複合体の E3 基質を認識する能力は、間接的なバインダーの認識が必要な状況を表しています。ユビキチン化プロテアソームによって媒介される 2 つの未知のパーキン基質が in situ で確認されています。
光線力学療法 (PDT)19 および発色団支援レーザー不活性化 (CALI)20 では、光増感剤による光照射により一重項酸素が生成され、標的タンパク質を不活性化するか、細胞死を引き起こす可能性があります。一重項酸素は、理論拡散距離が約70nmの反応性の高い物質であるため、光増感剤周辺の空間的に限られた酸化を制御することができます。この概念に基づいて、一重項酸素を使用して、生きている細胞内のタンパク質複合体の密接な標識を達成することにしました。我々は、4 つの機能を満たす PDPL ケモプロテオミクス アプローチを開発しました。(2) 光開始時に時間分解標識を提供します。(3) 変更による (4) バックグラウンドを減らすために内因性補因子 (ビオチンなど) の使用を避けるか、環境ストレスへの細胞の曝露を最小限に抑えるために非常に摂動する外因性試薬 (過酸化物など) を使用します。
光増感剤は、低分子量のフルオロフォア (ローズ ベンガル、メチレン ブルーなど) 22 と遺伝的にコードされた小さなタンパク質 (miniSOG、KillerRed など) 23 を含む 2 つのカテゴリに分けることができます。モジュール設計を実現するために、光増感剤 (PS) タンパク質を POI24,25 に追加することにより、第 1 世代の PDPL プラットフォームを開発しました (図 1a)。青色光が照射されると、一重項酸素は近位の求核性アミノ酸残基を酸化し、求電子性であり、アミンプローブ求核剤とさらに反応することができる極性を極性化します16,17。プローブは、LC/MS/MS キャラクタリゼーションのためのクリックケミストリーおよびプルダウンを可能にするアルキン ハンドルを使用して設計されています。
miniSOG を介したタンパク質複合体の標識の模式図。青色光にさらされると、miniSOG-POI を発現する細胞は一重項酸素を生成し、相互作用タンパク質を修飾しますが、非結合タンパク質は修飾しません。光酸化の中間生成物は、アミン化学プローブのリレー ラベルによって傍受され、共有付加物を形成します。化学プローブのアルキニル基により、プルダウンとそれに続く LC-MS/MS 定量による濃縮のためのクリックケミストリーが可能になります。b アミンプローブの化学構造 1-4.cプローブ1〜4を使用したミトコンドリアに局在するminiSOGを介したプロテオミクスマーカーの代表的な蛍光ゲル分析と、ゲルデンシトメトリーに基づく相対定量。化学プローブのシグナル対バックグラウンド比は、青色光を除くネガティブ コントロール実験を使用するか、または miniSOG 発現のない HEK293T 細胞を使用して評価されました。n = 2 の生物学的に独立したサンプル。各ドットは生物学的レプリカを表します。d cのような示されたPDPL成分の存在下または非存在下で最適化されたプローブ3を使用したPDPLの代表的な検出および定量化。n = 3 つの生物学的に独立したサンプル。各ドットは生物学的レプリカを表します。中心線とひげは、平均と ± 標準偏差を表します。CBB：クマシーブリリアントブルー。e遠赤色Si-DMA染色による一重項酸素の共焦点イメージング。スケール バー: 10 μ m。ゲルイメージングと共焦点実験は、独立して少なくとも2回繰り返され、同様の結果が得られました。
HEK293Tで安定して発現する成熟した光増感剤miniSOG26およびKillerRed23が、化学プローブとしてプロテオームのプロパルギルアミン標識を媒介する能力を最初にテストしました（補足図1a）。ゲル蛍光分析は、miniSOG と青色光照射を使用して全プロテオーム標識が達成されたことを示しましたが、KillerRed では目に見える標識生成物は観察されませんでした。シグナル/バックグラウンド比を改善するために、アニリン (1 および 3)、プロピルアミン (2)、またはベンジルアミン (4) を含む一連の化学プローブをテストしました。我々は、HEK293T 細胞自体が、おそらく内因性のリボフラビン光増感剤であるフラビンモノヌクレオチド (FMN) 27 により、青色光がない場合と比較してバックグラウンドシグナルが高いことを観察しました。 アニリンベースの化学プローブ 1 および 3 はより優れた特異性を示し、HEK293T はミトコンドリアで miniSOG を安定して発現し、プローブ 3 のシグナルが 8 倍以上増加しました。おそらくRNAとタンパク質の間の異なる反応性の好みによるものと思われます（図1b、c）。 アニリンベースの化学プローブ 1 および 3 はより優れた特異性を示し、HEK293T はミトコンドリアで miniSOG を安定して発現し、プローブ 3 のシグナルが 8 倍以上増加しました。おそらくRNAとタンパク質の間の異なる反応性の好みによるものと思われます（図1b、c）。アニリンベースの化学プローブ 1 および 3 は、より優れた特異性を示しました。ミトコンドリアで miniSOG を安定して発現する HEK293T は、プローブ 3 のシグナルで 8 倍以上の増加を示しますが、プローブ 2 は CAP-seq RNA 標識法でのみ使用されます。おそらくRNAとタンパク質の間の反応性の好みが異なるため、約2.5倍のシグナル増加を示します（図1b、c）。核酸に基づく化学プローブ 1 および 3 は、より優れた特異性を持ち、HEK293T は miniSOG を発現し、プローブ 3 のシグナルは > 8 倍増加し、RNA 標識法 CAP-seq のプローブ 2 は、シグナルが 2.5 倍に増加しました。これは、RNA とタンパク質の間の異なる反応の影響による可能性があります（図 1b、c）。苯胺に基づく化学プローブ 1 および 3 は、より特異性が高く、hek293t は粒体中に表された minisog を定義します。 -2倍のシグナル増加、おそらくRNAによるものアニリンベースの化学プローブ 1 および 3 は特異性が高く、HEK293T はミトコンドリアで miniSOG を安定して発現し、プローブ 3 はシグナルが 8 倍以上増加しましたが、CAP-seq RNA 標識法のプローブ 2 はわずか 2.5 倍の増加を示しました。おそらく、RNAとタンパク質の間の反応の好みが異なるためです（図1b、c）。さらに、プローブ3異性体とヒドラジンプローブ（プローブ5、6、7）をテストし、プローブ3の最適化を確認しました（補足図1b、c）。同様に、ゲル内蛍光分析により、他の最適化された実験パラメーターが明らかになりました：照射波長（460 nm）、化学プローブ濃度（1 mM）、および照射時間（20分）（補足図2a–c）。PDPLプロトコルのコンポーネントまたはステップを省略すると、バックグラウンドへの有意な信号反転が生じました（図1d）。特に、一重項酸素をクエンチすることが知られているアジ化ナトリウムまたはトロロックスの存在下では、タンパク質の標識が大幅に減少しました。一重項酸素を安定化することが知られている D2O の存在は、標識シグナルを増強します。標識に対する他の活性酸素種の寄与を調査するために、マンニトールとビタミン C を添加して、それぞれヒドロキシルとスーパーオキシド ラジカル スカベンジャーを確立しました 18, 29 が、標識を減少させることはわかりませんでした。照明ではなくH2O2の添加は、標識化をもたらさなかった（補足図3a）。Si-DMA プローブを使用した蛍光一重項酸素イメージングにより、HEK293T-miniSOG ワイヤに一重項酸素が存在することが確認されましたが、元の HEK293T ワイヤには存在しませんでした。さらに、mitoSOX Red は照射後のスーパーオキシド生成を検出できませんでした (図 1e および補足図 3b) 30。PDPLの細胞毒性は、青色光照射と化学プローブを含めて評価され、有意な細胞毒性は観察されませんでした（補足図4a）。
標識メカニズムを研究し、LC-MS/MS を使用してタンパク質複合体のプロテオミクス同定を可能にするために、まずどのアミノ酸が修飾されているか、プローブ標識のデルタ質量を決定する必要があります。メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンは、一重項酸素によって修飾されることが報告されています。TOP-ABPP31 ワークフローを、MSFragger32 に基づく FragPipe コンピューティング プラットフォームによって提供される公平なオープン検索と統合します。一重項酸素修飾と化学プローブ標識の後、切断可能なリンカーを含むビオチン還元標識を使用してクリックケミストリーを実行し、続いてニュートラアビジンストレッチングとトリプシン消化を行いました。まだ樹脂に結合している修飾ペプチドは、LC-MS / MS分析のために光分解されました（図2aおよび補足データ1）。プロテオーム全体で多数の修飾が発生し、50を超えるペプチドマップ（PSM）の一致がリストされました（図2b）。驚くべきことに、おそらく他のアミノ酸よりもアニリンプローブに対する酸化ヒスチジンの反応性が高いため、ヒスチジンの修飾のみが観察されました。一重項酸素によるヒスチジン酸化の公表されたメカニズムによると、21,33 提唱された +229 Da のデルタ質量構造は、2 回の酸化後のプローブ 3 と 2-オキソ-ヒスチジンの付加物に対応し、+247 Da は加水分解生成物です。 +229 Daの（補足図5）。MS2スペクトルの評価は、修飾されたフラグメントイオン（yおよびb）の同定を含む、ほとんどのyおよびbイオンの同定の高い信頼性を示しました（図2c）。PDPL修飾ヒスチジンの局所配列のコンテキスト分析により、±1位置の小さな疎水性残基に対する中程度のモチーフ優先が明らかになりました（補足図4b）。平均して、タンパク質あたり1.4個のヒスチジンが同定され、これらのマーカーの部位は、溶媒接触表面積（SASA）および相対溶媒利用可能性（RSA）分析によって決定されました（補足図4c、d）。
MSFragger を搭載した FragPipe コンピューティング プラットフォームを使用して残留選択性を研究するための偏りのないワークフロー。切断可能なリンカーは、クリックケミストリーで使用され、ストレプトアビジン樹脂からの修飾ペプチドの光切断を可能にします。多数の変更と関連する残骸を特定するために、公開検索が開始されました。b プロテオーム全体で発生する修飾の質量を割り当てます。ペプチドマッピングPSM。c プローブ 3 で修飾されたヒスチジン部位の MS2 スペクトル注釈。代表的な例として、プローブ 3 との共有結合反応により、修飾アミノ酸に +229.0938 Da が付加されました。d PDPLマーカーのテストに使用される突然変異アッセイ。ＰＲＤＸ３（Ｈ１５５Ａ、Ｈ２２５Ａ）およびＰＲＤＸ１（Ｈ１０Ａ、Ｈ８１Ａ、Ｈ１６９Ａ）は、抗Ｆｌａｇ検出のために野生型プラスミドでトランスフェクトされた。e合成ペプチドをプローブ3の存在下で精製miniSOGと反応させ、LC-MSスペクトルでΔm + 247および+ 229の対応する生成物が認められました。f miniSOG-6xHisタグおよび抗6xHis抗体でモデル化されたインビトロタンパク質間相互作用。アンチビオチン (ストレプトアビジン-HRP) およびプローブ 3 で標識された miniSOG-6xHis/抗 6xHis 抗体複合体の抗マウス ウエスタンブロット分析 (光への曝露時間に依存)。個々のタンパク質のラベルは、対応する分子量で表されます: LC 抗体軽鎖、HC 抗体重鎖。これらの実験は、独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。
標識部位の生化学的検証のために、質量分析によって同定された PRDX3 および PRDX1 をヒスチジンからアラニンに変更し、トランスフェクションアッセイで野生型と比較しました。PDPLの結果は、変異により標識が大幅に減少したことを示しました（図2d）。一方、オープンサーチで同定されたペプチド配列を合成し、in vitro でプローブ 3 および青色光の存在下で精製 miniSOG と反応させ、LC-MS で検出すると +247 および +229 Da の質量シフトを持つ生成物を生成しました (図. 2e)。）。相互作用する近位タンパク質を in vitro で miniSOG 光活性化に応答して標識できるかどうかをテストするために、in vitro での miniSOG-6xHis タンパク質と抗 His モノクローナル抗体との相互作用による人工近接アッセイを設計しました (図 2f)。このアッセイでは、miniSOG による抗体の重鎖および軽鎖の近位標識が予想されました。実際、抗マウス (抗 6xHis 標識抗体の重鎖と軽鎖を認識する) およびストレプトアビジンのウエスタンブロットは、重鎖と軽鎖の強力なビオチン化を示しました。特に、6xHis タグと軽鎖と重鎖の間の架橋による miniSOG 自己ビオチン化に気付きました。結論として、PDPL は近接依存的にヒスチジンを修飾すると結論付けます。
私たちの次の目標は、細胞内プロテオームを特徴付けて、in situ 標識の特異性をテストすることでした。したがって、HEK293T細胞の核、ミトコンドリアマトリックス、またはER外膜でminiSOGを安定して発現させました（図3a）。ゲル蛍光分析により、3つの細胞内位置に豊富な標識バンドと異なる標識パターンが明らかになりました（図3b）。蛍光イメージング分析は、PDPLの高い特異性を示しました（図3c）。PDPL ワークフローに続いて、ローダミン色素によるクリック反応を行い、蛍光顕微鏡を使用して細胞内プロテオームを描写し、PDPL シグナルを DAPI、ミトコンドリア トラッカー、または ER トラッカーと共局在化し、PDPL の高い忠実度を確認しました。3 つのオルガネラの位置について、アビジン ウエスタン ブロットを使用して PDPL と TurboID を並べて比較すると、それぞれのコントロールと比較して PDPL がより特異的に標識されていることが示されました。PDPL条件下では、より多くの標識バンドが現れ、より多くのPDPL標識タンパク質を示しています（補足図6a-d）。
a miniSOG を介したオルガネラ特異的プロテオーム標識の模式図。miniSOG は、ヒト COX4 の N 末端 23 アミノ酸への融合を介してミトコンドリア マトリックス (mito-miniSOG)、H2B への融合を介して核 (nucleus-miniSOG)、および ER 膜の細胞質側を介して Sec61β (ER-miniSOG) を標的とします。 ）。適応症には、ゲルイメージング、共焦点イメージング、および質量分析が含まれます。b 3 つのオルガネラ固有の PDPL プロファイルの代表的なゲル画像。CBBクーマシーブリリアントブルー.c V5標識抗体（赤）によって検出された異なる細胞内局在を有するminiSOGを安定して発現するHEK293T細胞の代表的な共焦点画像。細胞内マーカーは、ミトコンドリアと ER (緑) に使用されます。PDPL ワークフローには、Cy3-アジド クリック ケミストリーを使用した miniSOG (黄色) 標識細胞内プロテオームの検出が含まれます。スケール バー: 10 μ m。dラベルなしの定量化によって定量化された、さまざまなオルガネラのPDPLタグ付きプロテオームの火山プロット（n = 3の独立した生物学的実験）。両側スチューデントの t 検定は、火山プロットで使用されました。HEK293T 野生型をネガティブ コントロールとして使用しました。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 これは、最も重要な問題である (p < 0,05 および >2-kратная разица в интенсивности ионов)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 およびイオン強度の >2 倍の差)。変化したタンパク質が、色で突出している（p < 0.05 および > 2 倍のイオン強度の差）。変化したタンパク質は、色で突出して表示されます（p < 0.05 and > 2 これは、最も重要な問題である (p < 0,05 および > 2-kратная разница в ионной силе)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 およびイオン強度の > 2 倍の差)。HEK293T-miniSOG にとって重要であるが HEK293T にとって重要ではない関連タンパク質は緑色で表示されます。e 実験からのプロテオミクス データセットの特異性の分析 d.各オルガネラ (赤と緑の点) の統計的に有意なタンパク質の総数は、上部にマークされています。ヒストグラムは、MitoCarta 3.0、GO 分析、および A. Ting らに基づいてオルガネラに局在するタンパク質を示しています。人。ミトコンドリア、核、および ER の個別のデータセット。これらの実験は、独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。生データは、生データ ファイルの形式で提供されます。
ゲルとイメージングの結果に励まされて、ラベルフリーの定量化を使用して、各オルガネラで特定されたプロテオームを定量化しました（補足データ2）。トランスフェクトされていない HEK293T をネガティブ コントロールとして使用して、バックグラウンド マーカーを差し引いた。 火山プロット分析は、大幅に濃縮されたタンパク質（p <0.05および> 2倍のイオン強度）と、miniSOG発現系統にのみ存在するシングルトンタンパク質を示しました（図3dの赤と緑の点）。 火山プロット分析は、大幅に濃縮されたタンパク質（p <0.05および> 2倍のイオン強度）と、miniSOG発現系統にのみ存在するシングルトンタンパク質を示しました（図3dの赤と緑の点）。 Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). 火山プロット分析は、有意に濃縮されたタンパク質（p <0.05および> 2倍のイオン強度）と、miniSOG発現系統にのみ存在する単一タンパク質を示しました（図3d、赤と緑の点）。火山図分析は、濃縮されたタンパク質 (p < 0.05 および>2 倍のタンパク質) と、miniSOG 表系にのみ存在する単一のタンパク質 (図 3d の色と色の点) を示しています。火山図分析は、タンパク質が存在することを示しています (p < 0.05 および > 2 倍のタンパク質強度)。 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). 火山プロット分析により、大幅に濃縮されたタンパク質（p <0.05および> 2xイオン強度）と、miniSOG発現系統にのみ存在する単一タンパク質（図3dの赤と緑の点）が明らかになりました。これらのデータを組み合わせて、それぞれ 1364、461、および 911 の統計的に有意な核、ミトコンドリア、および ER 外膜タンパク質を特定しました。オルガネラに局在する PDPL の精度を分析するために、MitoCarta 3.0、Gene Ontology (GO) 分析、および A. Ting et al. を使用しました。73.4、78.5、および73.0％の精度に対応する、検出されたタンパク質の細胞小器官の特異性をテストするために、ミトコンドリア、核、およびERにデータセット8が使用されました（図3e）。PDPL の特異性は、PDPL がオルガネラ固有のプロテオームを識別するための理想的なツールであることを裏付けています。特に、同定されたミトコンドリアタンパク質のサブミトコンドリア分析は、トラップされたプロテオームが主にマトリックスと内膜に分布し（それぞれ226と106）、同定されたミトコンドリアタンパク質の総数の91.7％（362）を占めることを示しました。高レベルのPDPLがさらに確認されました（補足図7a）。同様に、核内分析は、捕捉されたプロテオームが主に核、核質、および核小体に分布していることを示しました（補足図7b）。核局在化シグナルペプチド（3xNLS）を使用した核プロテオミクス分析は、H2Bコンストラクトと同様の精度を示しました（補足図7c–h）。PDPL マーカーの特異性を決定するために、核ラミニン A をより離散的に局在する POI7 トラップとして選択しました。PDPL は 36 の有意に濃縮されたタンパク質を同定し、そのうち 12 のタンパク質 (ラミン A を含む 30.0%) は、BioID メソッド (122 タンパク質) よりも高いパーセンテージで、String データベースによって注釈が付けられた、十分に特徴付けられたラミン A 相互作用タンパク質でした。 %) 7. 私たちの方法は、より少ない活性な一重項酸素によって可能になった限られた標識領域のために、おそらくより少ないタンパク質を識別しました。GO分析は、同定されたタンパク質が主に核質(26)、核膜(10)、核膜(9)、および核膜孔(5)に位置することを示した。まとめると、これらの核局在タンパク質は濃縮タンパク質の80％を占め、PDPLの特異性をさらに示しています（補足図8a–d）。
オルガネラで近接マーキングを実行する PDPL の機能を確立したので、PDPL を使用して POI 結合パートナーを分析できるかどうかをテストしました。特に、細胞質タンパク質の PDPL 分析を定義しようとしました。細胞質タンパク質は、非常に動的な性質のため、膜に局在する対応物よりも難しいターゲットと見なされています。ブロモドメインおよびエクストラターミナル (BET) タンパク質である BRD4 は、さまざまな疾患における重要な役割のために注目を集めています 35, 36 。BRD4 によって形成される複合体は、転写コアクチベーターであり、重要な治療標的です。c-myc および Wnt5a 転写因子の発現を調節することにより、BRD4 は急性骨髄性白血病 (AML)、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、結腸がん、および炎症性疾患の重要な決定因子であると考えられています 37,38。さらに、パピローマウイルス、HIV、SARS-CoV-236,39 などの一部のウイルスは、BRD4 を標的としてウイルスおよび細胞の転写を調節します。
PDPLを使用してBRD4相互作用をマッピングするために、miniSOGをBRD4の短いN末端またはC末端アイソフォームと組み合わせました。プロテオミクスの結果により、2つのコンストラクト間の高度な重複が明らかになりました（補足図9a）。miniSOG-H2Bで同定された核プロテオームは、BRD4と相互作用するタンパク質の77.6％をカバーしています（補足図9b）。次に、さまざまな照明時間（2、5、10、20分）を使用して、マーカー半径を調整しました（図4aおよび補足データ3）。短い光周期では、PDPL は主に直接結合パートナーを標識し、長い周期では、短い光活性化期間中に識別されたタンパク質や、複合体の標識における間接的なターゲットが含まれると結論付けます。実際、隣接する時点間で強い重複が見られました（2分と5分で84.6％、5分と10分で87.7％、10分と20分で98.7％）（図4bおよび補足図9c）。すべての実験グループで、BRD4 自己標識だけでなく、MED1、CHD8、BICRA、NIPBL、SMC1A、HMGB1 などのいくつかの既知のターゲットが文字列データベースで注釈付けされていることがわかりました。これらのターゲットのイオン強度は、曝露時間に比例します（図4cおよび補足図9d）。2分間グループで同定されたタンパク質のGO分析は、同定されたタンパク質が核に局在し、クロマチンリモデリングとRNAポリメラーゼ機能に関与していることを示しました。タンパク質の分子機能は、BRD4機能と一致して、クロマチン結合または転写共活性化が豊富でした（図4d）。文字列データベース対応のタンパク質相互作用分析により、BRD4とHDACファミリー相互作用複合体（SIN3A、NCOR2、BCOR、SAP130など）との間の最初のレベルの間接的相互作用が明らかになり（図4eおよび補足図9e）、BRD4およびHDAC結合アセチル化ヒストンと一致しました..さらに、Sin3A、NSUN2、Fus、および SFPQ を含む、LC-MS/MS によって特定された代表的なターゲットは、ウェスタンブロッティングによって確認されました (図 4f)。最近、BRD4 の短いアイソ フォームが液液相分離 (LLPS) 特性を持つ核を形成することが報告されています。RNA 結合タンパク質である Fus および SFPQ は、さまざまな細胞プロセスの LLPS を媒介し、ここでは記録されていない BRD4 結合タンパク質として特定されています。BRD4とSFPQの間の相互作用は、共免疫沈降（co-IP）実験によって確認され（図4g）、BRD4を介した液液相分離の別のメカニズムがさらに調査に値することが示唆されました。まとめると、これらの結果は、PDPL が既知の BRD4 相互作用および未知の結合タンパク質を識別するための理想的なプラットフォームであることを示唆しています。
a miniSOG を介した BRD4 近接マーキングの概略図、露出時間: 2、5、10、および 20 分。b異なる照明時間で識別されたタンパク質の重なり。HEK293T-miniSOG-BRD4 で識別されたタンパク質濃縮は、野生型 HEK293T と比較して統計的に有意でした。c指定された曝露時間中に未標識の代表的な既知のBRD4結合タンパク質を定量する際のイオン強度。n = 3 つの生物学的に独立したサンプル。データは、平均 ± 標準偏差として表示されます。d 2分間のグループで同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー分析（GO）。最初の 10 個の GO 用語がリストされています。バブルは GO ターム カテゴリに従って色付けされ、バブルのサイズは各タームで見つかったタンパク質の数に比例します。e BRD4と相互作用するタンパク質の文字列分析。黄色の円は直接接着剤で、灰色の円は間接接着剤の最初の層です。赤い線は実験的に決定された相互作用を表し、青い線は予測された相互作用を表します。f LC-MS / MSで特定された代表的なBRD4結合標的は、ウェスタンブロッティングによって検証されました。g共免疫沈降実験により、SFPQとBRD4の間の相互作用が確認されます。これらの実験は、独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。生データは、生データ ファイルの形式で提供されます。
未登録のPOI関連ターゲットを特定することに加えて、PDPLは酵素の基質を特定するのに適していると仮定します。これには、未登録の基質に注釈を付けるために、大きな複合体中の間接結合タンパク質の特性評価が必要になります。パーキン (PARK2 によってコードされる) は E3 リガーゼであり、パーキンの変異は常染色体劣性若年性パーキンソン病 (AR-JP) を引き起こすことが知られています 42。さらに、パーキンは、マイトファジー (ミトコンドリアのオートファジー) と活性酸素種の除去に不可欠であると説明されています。しかし、いくつかのパーキン基質が同定されていますが、この疾患におけるパーキンの役割は不明のままです。その特徴付けられていない基質に注釈を付けるために、パーキンの N 末端または C 末端に miniSOG を追加して PDPL をテストしました。ＰＩＮＫ１－パーキン経路を介してパーキンを活性化するために、細胞をシアン化カルボニルプロトントランスポーターｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）で処理した。BRD4 PDPLの結果と比較して、パーキンN末端融合は、C末端の大部分をカバーしていましたが（210のうち177）、より多くの標的タンパク質のセットを明らかにしました（図5a、bおよび補足データ4）。結果は、N 末端タグが異常に Parkin44 を活性化できるという報告と一致しています。驚くべきことに、おそらく細胞株とプロテオミクス ワークフローの違いが原因で、Parkin43 の AP-MS の結果が公開されているデータでは、重複するタンパク質は 18 個しかありませんでした。2つの方法で同定された4つの既知のタンパク質（ARDM1、HSPA8、PSMD14、およびPSMC3）に加えて（図5c） 。LC-MS/MS の結果をさらに検証するために、PDPL 処理とその後のウェスタンブロッティングを使用して、HEK293T 親細胞アッセイと安定した N 末端パーキン ラインの結果を比較しました。これまで知られていないターゲットCDK2、DUT、CTBP1、およびPSMC4は、既知のバインダーDNAJB1でテストされました（図5d）。
パーキンの N 末端または C 末端に融合した miniSOG を安定して発現させた HEK293T 細胞におけるパーキン相互作用タンパク質の火山プロット (n = 3 の独立した生物学的実験)。両側スチューデントの t 検定は、火山プロットで使用されました。HEK293T をネガティブ コントロールとして使用しました。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 これは、最も重要な問題である (p < 0,05 および >2-kратная разица в интенсивности ионов)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 およびイオン強度の >2 倍の差)。変化したタンパク質が、色で突出している（p < 0.05 および > 2 倍のイオン強度の差）。変化したタンパク質は、色で突出して表示されます（p < 0.05 and > 2 これは、最も重要な問題である (p < 0,05 および > 2-kратная разница в ионной силе)。 大幅に変更されたタンパク質は赤で強調表示されます (p < 0.05 およびイオン強度の > 2 倍の差)。HEK293T-miniSOG にとって重要であるが HEK293T にとって重要ではない関連タンパク質は緑色で表示されます。b N末端構築物とC末端構築物との間の重複タンパク質を示すベン図。N末端タグは、パーキンを異常に活性化し、より認識しやすいタンパク質をもたらす可能性があります。c PDPLとAP-MSの間のタンパク質の重複を示すベン図。18 のオーバーラップするタンパク質のうち 4 つ、PDPL で特異的に同定された 159 のタンパク質のうち 11 を含む、既知のインタラクターがリストされています。d LC-MS / MSによって特定された代表的なターゲットは、ウェスタンブロッティングによって検証されました。e Ssu72 および SNW1 は未登録のパーキン基質として同定されました。これらの FLAG タグ付きタンパク質プラスミドを HEK293T および HEK293T-Parkin-miniSOG にトランスフェクトした後、さまざまな時点で CCCP 処理を行いました。劣化は、パーキン過剰発現系統でより顕著でした。f プロテアソーム阻害剤 MG132 を使用して、Ssu72 および SNW1 の分解プロセスがプロテアソームのユビキチン化によって媒介されることが確認されました。これらの実験は、独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。生データは、生データ ファイルの形式で提供されます。
特に、PDPL によって識別されるタンパク質には、パーキン結合タンパク質とその基質が含まれている必要があります。未登録のパーキン基質を検出するために、7 つの同定されたタンパク質 (PUF60、PSPC1、UCHL3、PPP1R8、CACYBP、Ssu72、および SNW1) を選択し、プラスミドをトランスフェクトして、これらの遺伝子を通常の HEK293T に曝露し、miniSOG-Parkin の HEK293T を安定して発現させた後、CCCP 処理を行いました。Ssu72およびSNW1タンパク質のレベルは、安定したminiSOG-Parkin系統で大幅に減少しました（図5e）。CCCP で 12 時間処理すると、両方の基質が最も著しく分解されました。Ssu72およびSNW1の分解がプロテアソームのユビキチン化によって調節されているかどうかを調べるために、プロテアソーム活性を阻害するためにプロテアソーム阻害剤MG132を追加しました。実際、それらの分解プロセスが阻害されることがわかりました（図5f）。追加の非基質標的は、ウエスタンブロッティングを使用してパーキン相互作用因子として確認され（補足図10）、LC-MS / MSと一致した結果を示しました。結論として、PDPL ワークフローと標的タンパク質のトランスフェクション検証の統合により、未登録の E3 リガーゼ基質の同定が可能になります。
空間的および時間的に相互作用する POI を識別できる共通の近接マーキング プラットフォームを開発しました。このプラットフォームは、わずか約 12 kDa の miniSOG 光増感タンパク質に基づいており、成熟した APEX2 酵素 (27 kDa) の半分以下のサイズで、TurboID (35 kDa) の 3 分の 1 のサイズです。小さいサイズは、小さなタンパク質インタラクトームを研究するためのアプリケーションの範囲を大幅に拡大するはずです。一重項酸素の量子収量を増やし、このアプローチの感度を拡大するには、遺伝的にコードされたタンパク質であれ小分子であれ、追加の光増感剤のさらなる調査が必要です。miniSOG の現在のバージョンでは、青い照明を使用して近接マーカーをアクティブにすることで、高い時間分解能を実現できます。さらに、露出時間が長くなると、一重項酸素のより大きな「雲」が放出され、その結果、より遠位のヒスチジン残基が修飾され、標識半径が増加し、PDPL 空間分解能を微調整できるようになりました。また、信号とバックグラウンドの比率を高めるために 7 つの化学プローブをテストし、このアプローチの背後にある分子メカニズムを調査しました。公平なオープン検索と組み合わせた TOP-ABPP ワークフローにより、変更はヒスチジンでのみ発生し、ループ領域のヒスチジンに対する中程度の優先度を除いて、ヒスチジン変更の増加に対して一貫した微小環境は観察されないことが確認されました。
PDPL は、プロテオームの特異性と、少なくとも他の近接標識やオルガネラ特異的化学プローブ法に匹敵するカバレッジを備えた細胞内プロテオームの特徴付けにも使用されています。近接マーカーは、表面、リソソーム、およびセクレトーム関連プロテオームの特徴付けにも使用されています46,47。PDPL は、これらの細胞内小器官と互換性があると考えています。さらに、動的特性とより時間的な相互作用への関与により、膜結合タンパク質よりも複雑なサイトゾルタンパク質結合の標的を特定することにより、PDPLに挑戦しました。PDPL は、転写コアクチベーター BRD4 と疾患関連リガーゼ E3 パーキンの 2 つのタンパク質に適用されました。これら 2 つのタンパク質は、その基本的な生物学的機能だけでなく、臨床的関連性と治療の可能性のためにも選択されました。これら 2 つの POI については、既知のバインディング パートナーと未登録のターゲットが特定されました。特に、相分離関連タンパク質 SFPQ は co-IP によって確認されました。これは、BRD4 (短いアイソフォーム) が LLPS を調節する新しいメカニズムを示している可能性があります。同時に、パーキン基板の識別は、間接接着剤の識別が必要なシナリオであると考えています。2 つの未確認のパーキン基質を特定し、ユビキチン化-プロテアソーム経路に沿った分解を確認しました。最近、加水分解酵素基質を酵素でトラップすることにより検出するメカニズムベースのトラップ戦略が開発されました。これは非常に強力な方法ですが、大きな複合体の形成に関与する基質の分析には適しておらず、酵素と基質の間の共有結合の形成が必要です。PDPL を拡張して、deubiquitinase や metaloprotease ファミリーなどの他のタンパク質複合体や酵素ファミリーを研究できると期待しています。
SOPP3 と呼ばれる新しい形態の miniSOG が開発され、一重項酸素の生成が改善されました。miniSOGとSOPP3を比較したところ、信号対雑音比は変化しませんでしたが、マーキング性能が向上していることがわかりました（補足図11）。SOPP3 の最適化 (例えば、定向進化による) は、より短い光時間を必要とするより効率的な光増感剤タンパク質につながり、より動的な細胞プロセスを捉えることができるという仮説を立てました。特に、PDPL の現在のバージョンは、青色光照明を必要とし、深部組織に浸透できないため、細胞環境に限定されています。この機能により、動物モデル研究での使用が妨げられます。ただし、光遺伝学と PDPL の組み合わせは、特に脳における動物研究の機会を提供する可能性があります。さらに、他の設計された赤外線光増感剤もこの制限を取り除きます。現在、この分野で研究が進められています。
HEK293T 細胞株は ATCC (CRL-3216) から入手しました。細胞株はマイコプラズマ感染に対して陰性であり、10% ウシ胎児血清 (FBS、Vistech、#SE100-B) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Hyclone、#SV30010) を添加した DMEM (Thermo、#C11995500BT) で培養されました。で育った。
3-アミノフェニレン (サンプル 3) および (4-エチニルフェニル) メタンアミン (サンプル 4) は、Bidepharm から購入しました。プロピルアミン (プローブ 2) は Energy-chemicals から購入しました。N-(2-アミノフェニル)ペント-4-イナミド (プローブ 1) は、公開されている方法に従って合成されました。
補足表1は、この研究で使用された遺伝子構築物を示しています。miniSOG および KillerRed 配列は、P. Zou (北京大学) からのギフト プラスミドからクローニングされました。ミトコンドリア マトリックス ターゲティング シーケンスは、COX4 の 23 個の N 末端アミノ酸に由来し、Gibson アセンブリ (Beyotime、#D7010S) を使用して示されたベクターにクローニングされました。小胞体の膜と核を標的とするために、HEK293T 細胞の cDNA ライブラリーから PCR によって増幅された SEC61B ヒト DNA (NM_006808.3) (NEB、#M0491L)、および H2B DNA (D. Lin、Shenzhen Bay Laboratory から寄贈)上記のように、そして cloned 。特に明記しない限り、トランスフェクションおよび安定した細胞株の構築に使用される他のタンパク質遺伝子は、HEK293T細胞cDNAライブラリーからPCR増幅されました。G3S (GGGS) および G4S (GGGGS) は、ベイトタンパク質と miniSOG の間のリンカーとして使用されました。V5 エピトープ タグ (GKPIPNPLLGLDST) がこれらの融合コンストラクトに追加されました。哺乳類での発現と安定した細胞株の確立のために、miniSOG 融合コンストラクトを pLX304 レンチウイルスベクターにサブクローニングしました。細菌発現のために、miniSOG を C 末端で 6xHis とラベル付けされた pET21a ベクターにクローニングしました。
HEK293T 細胞を 6 ウェル プレートにウェルあたり 2.0 x 105 細胞で播種し、24 時間後に、Lipo8000 (Beyotime 、#C0533)、約 80% 融合。一晩トランスフェクションした後、培地を交換し、さらに 24 時間インキュベートしました。ウイルスの収集は、24、48、および 72 時間後に実行されました。標的細胞株の感染前に、ウイルス培地を0.8μmフィルター（Merck、#millex-GP）でろ過し、ポリブレン（Solarbio、#H8761）を8μg/ mlの濃度で添加しました。24時間後、培地を交換して細胞を回復させた。低ストリンジェントな選択として、最初の 3 回の継代で 5 μg/ml ブラストサイジン (Solarbio、#3513-03-9) を使用して細胞を選択しました。その後、次の 3 回の継代ではより厳密なレジメンとして 20 μg/ml を使用しました。
細胞を 12 ウェル チャンバー (Ibidi、#81201) にウェルあたり約 20,000 細胞の密度で播種しました。HEK293T 細胞の接着を改善するには、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、Sangon、#B640435) で希釈した 50 μg/ml フィブロネクチン (Corning、#356008) を 37°C で加えます。チャンバーを１時間前処理した後、ＰＢＳで除去した。24 時間後、細胞を PBS で 1 回洗浄し、新鮮なハンクス平衡塩類溶液 (HBSS、Gibco、#14025092) 中の 1 mM プローブ 3 とともに 37°C で 1 時間インキュベートし、青色 LED (460 nm) とともにインキュベートしました。 ）。) 室温で 10 分間照射した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ｅ６７２００２）で室温で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄することにより、過剰なホルムアルデヒドを固定細胞から除去した。次いで、細胞をＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ａ６００１９８）で透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。次にチャンバーを取り外し、50 μM Cy3-azide (Aladdin、#C196720)、2 mM CuSO4 (Sangon、#A603008)、1 mM BTTAA (Confluore、#BDJ-4) を含むクリック反応混合物 25 μl を各サンプルに加えます。および 0.5 mg/ml アスコルビン酸ナトリウム (Aladdin、番号 S105024) を加え、室温で 30 分間インキュベートします。スナップ反応の後、細胞を 0.05% Tween-20 (Sangon、#A600560) を含む PBS (PBST) で 6 回洗浄し、5% BSA (Abcone、#B24726) を含む PBST で室温で 30 分間ブロックしました。
共局在免疫染色のために、細胞を指定された条件に従って一次抗体とともにインキュベートしました: マウス抗 V5 タグ mAb (1:500、CST、#80076)、ウサギ抗 Hsp60 mAb (1:1000)、ABclonal、#A0564)、ウサギ ポリクローナル抗カルネキシン抗体 (1:500、Abcam、#ab22595) またはウサギ抗ラミン A/C モノクローナル抗体 (1:500; CST、#2032) を 4 °C で一晩。PBST で 3 回洗浄した後、細胞を二次抗体と共にインキュベートしました。希釈 室温で 30 分間希釈します。次いで、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１０分間、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃Ｄ１３０６）で対比染色した。PBSで3回洗浄した後、イメージングのために細胞をPBS中の50%グリセロール(Sangon、#A600232)で密封した。免疫蛍光画像は、ZEISS LSM 900 Airyscan2 共焦点顕微鏡と ZNE 3.5 ソフトウェアを使用して取得しました。
一重項酸素蛍光イメージングのために、細胞をハンクス HEPES バッファーで 2 回洗浄した後、ハンクス HEPES バッファー (DOJINDO、#MT05) に 100 nM Si-DMA を加えました。光にさらした後、細胞を CO2 インキュベーター内で 37°C で 45 分間インキュベートしました。次に、細胞をハンクス HEPES 緩衝液で 2 回洗浄し、ハンクス HEPES 緩衝液中の Hoechst で室温で 10 分間対比染色し、ZEISS LSM 900 共焦点顕微鏡を使用して可視化しました。、#M36008) カルシウムとマグネシウムを含む HBSS バッファーで。光またはドキソルビシン (MCE、#HY-15142A) に曝露した後、細胞を CO2 インキュベーター内で 37℃ で 10 分間インキュベートし、HBSS バッファーで 2 回洗浄し、HBSS バッファー中、室温でヘキストと共にインキュベートした。分。ドキソルビシンをポジティブプローブコントロールとして使用し、細胞を1％BSAを含むHBSS中の20μMドキソルビシンで30分間処理しました。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ９００共焦点顕微鏡を用いて免疫蛍光画像を得た。
mito-miniSOG を安定して発現する HEK293T 細胞を、15 cm ディッシュに約 30% の密度で播種しました。48時間後、約80%のコンフルエンスに達したら、細胞をPBSで1回洗浄し、新鮮なHBSS緩衝液中の1mMプローブ3と共に37℃で1時間インキュベートし、青色LEDで10分間室温で照射した温度。.その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、掻き取り、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤（ＭＣＥ、＃ＨＹ－Ｋ００１１）を含む氷冷ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。チップを 1 分間超音波処理することにより細胞を溶解しました (35% の振幅で 1 秒オン、1 秒オフ)。得られた混合物を 15,871 xg で 10 分間、4°C で遠心分離して破片を除去し、BCA タンパク質アッセイ キット (Beyotime、#P0009) を使用して上清濃度を 4 mg/mL に調整しました。上記のライセート 1 mL を 0.1 mM 光分解性ビオチンアジド (Confluore、#BBBD-14)、1 mM TCEP (Sangon、#A600974)、0.1 mM TBTA リガンド (Aladdin、#T162437)、および底付きの 1 mM CuSO4 インキュベーターと組み合わせます。室温で1時間回転させます。スナップ反応後、混合物を 10 ml ガラスバイアル中の事前混合溶液 (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) に加えます。サンプルを混合し、室温で 4500 g で 10 分間遠心分離しました。上下の溶液を捨て、沈殿物をメタノール１ｍｌで２回洗浄し、４℃、１５８７１×ｇで５分間遠心分離した。25 mM 炭酸水素アンモニウム (ABC、アラジン、番号 A110539) に 8 M 尿素 (アラジン、番号 U111902) 1 ml を加えて、沈殿物を溶解します。サンプルを 10 mM ジチオスレイトール (Sangon、25 mM ABC 中の #A100281) で 55 °C で 40 分間再構成し、続いて 15 mM の新鮮なヨードアセトアミド (Sangon、#A600539) を室温、暗所で添加しました。30分以内のアルキル化。.追加の 5 mM ジチオスレイトールを添加して、反応を停止させました。1mlのPBSで3回洗浄することにより、各サンプルに対して約100μlのNeutrAvidinアガロースビーズ(Thermo、#29202)を準備します。上記のプロテオーム溶液を 5 ml の PBS で希釈し、事前に洗浄した NeutrAvidin アガロース ビーズと共に室温で 4 時間インキュベートしました。次いで、ビーズを０．２％ＳＤＳ（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ａ６００４８５）を含む５ｍｌのＰＢＳで３回、１Ｍ尿素を含む５ｍｌのＰＢＳで３回、５ｍｌのｄｄＨ ２ Ｏで３回洗浄した。次いで、ビーズを遠心分離によって回収し、１Ｍ尿素、１ｍＭ ＣａＣｌ ２ （Ｍａｃｋｌｉｎ、＃Ｃ８０５２２８）および２０ｎｇ／μｌトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｖ５２８０）を含有する２５ｍＭ ＡＢＣ ２００μｌに再懸濁した。回転させながら、37°C で一晩トリプシン処理します。ｐＨが２～３に達するまでギ酸（Ｔｈｅｒｍｏ、＃Ａ１１７－５０）を添加することによって反応を停止させた。０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳ１ｍｌで３回、１Ｍ尿素を含むＰＢＳ１ｍｌで３回、蒸留水１ｍｌで３回洗浄した。修飾されたペプチドは、200 μl の 70% MeOH を使用して 90 分間の光溶解 (365 nm) によって放出されました。遠心分離後、上清を回収した。次いで、ビーズを１００μｌの７０％ＭｅＯＨで１回洗浄し、上清をプールした。サンプルをSpeedvac真空濃縮器で乾燥させ、分析まで-20℃で保存しました。
一重項酸素修飾ペプチドを特定して定量化するために、サンプルを 0.1% ギ酸に再溶解し、1 μg のペプチドを、Tune のナノ ESI ソースとベンダー ソフトウェア 4.3 の Xcalibur を搭載した Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計を使用して分析しました。サンプルは、3 µm C18 材料 (ReproSil-pur、#r13.b9.) を含む 75 µm × 15 cm 内部充填キャピラリーカラムで分離し、EASY-nLC 1200 UHPLC システム (Thermo) に接続しました。ペプチドは、8% 溶媒 B から 50% 溶媒 B (A = 水中 0.1% ギ酸、B = 80% アセトニトリル中 0.1% ギ酸) までの 95 分間の線形グラジエント クロマトグラフィーによって分離され、98% B min まで直線的に増加しました。 300 NL /分の流量で6分で。Orbitrap Fusion Lumos は、データに応じてフル MS スキャンと MS2 スキャンを交互に収集します。スパッタリング電圧は 2.1 kV に設定し、イオン輸送キャピラリーの温度は 320°C でした。MS スペクトル (350 ～ 2000 m/z) は、分解能 120,000、AGC 4 × 105、最大入力時間 150 ms で収集されました。各フル スキャンで最も一般的な 10 の多価プリカーサーは、正規化された衝突エネルギー 30%、四重極アイソレーション ウィンドウ 1.6 m/z、分解能設定 30,000 で HCD を使用してフラグメント化されました。5×104 と最大入力時間 150 ms を使用したタンデム質量分析用の AGC ターゲット。動的例外は 30 秒に設定されています。 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。 Неназначенные または ионы или ионы с зарядом 1+ または >7+ または для МС/МС. 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。指定されていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で使用されます。指定されていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で使用されます。 Неуказанные または ионы или ионы с зарядами 1+ または >7+ または МС/МС. 特定されていないイオン、または電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。
生データは、MSFragger に基づく FragPipe コンピューティング プラットフォームを使用して処理されます。質量バイアスと対応するアミノ酸は、オープン検索アルゴリズムを使用して、前駆体質量許容値が -150 ～ 500 Da であると決定されました。次に、PD で +229.0964 および +247.1069 Da の質量増加を伴うヒスチジン修飾を使用して、修飾ペプチドを同定しました (Proteome Discoverer 2.5、Thermo)。
融合したｍｉｎｉＳＯＧ遺伝子を安定して発現する細胞を６ｃｍディッシュに播種した。約 80% のコンフルエンスに達したら、細胞を HBSS (Gibco、#14025092) で 1 回洗浄し、HBSS で化学プローブと共に 37°C で 1 時間インキュベートし、青色光で照らしました。室温で20分間10W LED。PDPL、0.5 mM ビタミン C (MCE、#HY-B0166)、5 mM Trolox (MCE、#HY-101445)、D2O (Sigma、#7789-20-0)、 100 mM マンニトール (Energy Chemical、#69-65-8)、100 μM H2O2、10 mM NaN3 をサプリメントとして細胞に添加しました。冷たい PBS で洗浄した後、細胞をこすり取り、1.5 ml の遠心管に集め、EDTA を含まない 1x プロテアーゼ阻害剤を含む 200 μl の PBS で 1 分間チップで超音波処理しました (1 秒および 1 秒なし、振幅 35%)。得られた混合物を 15,871 × g で 10 分間、4 °C で遠心分離し、BCA タンパク質アッセイ キットを使用して上清濃度を 1 mg/mL に調整しました。上記のライセート約 50 µl を 0.1 mM ローダミンアジド (Aladdin、番号 T131368)、1 mM TCEP、0.1 mM TBTA リガンド、および 1 mM CuSO4 とともに室温で 1 時間、下から上に回転させながらインキュベートしました。クリック反応後、事前に冷却したアセトン 250 μl をサンプルに加え、-20°C で 20 分間インキュベートし、4°C で 6010 xg で 10 分間遠心分離することにより、アセトンによる沈殿を行いました。ペレットを回収し、50 μl の 1x Laemmli 緩衝液で 95 °C で 10 分間沸騰させます。次に、サンプルを SDS-PAGE ロングゲルで分析し、Bio-rad ChemiDoc MP Touch イメージング システムと Image Lab Touch ソフトウェアを使用して可視化しました。
組換えｍｉｎｉＳＯＧ－６ｘＨｉｓタンパク質の発現および精製は、以前に記載されたように行った。簡単に説明すると、大腸菌 BL21(DE3) 細胞 (TransGen、#CD701-02) を pET21a-miniSOG-6xHis で形質転換し、0.5 mM IPTG (Sangon、#A600168) でタンパク質発現を誘導しました。細胞溶解後、Ni-NTA アガロース ビーズ (MCE、番号 70666) を使用してタンパク質を精製し、PBS に対して透析し、-80°C で保存しました。
抗体ベースの in vitro 標識近接アッセイの場合、100 μM 精製 miniSOG、1 mM プローブ 3、および 1 μg 抗標識マウス モノクローナル抗体 (TransGen、#HT501-01) を PBS で混合し、総反応量を 50 μl にします。.反応混合物を、室温で 0、2、5、10、および 20 分間、青色 LED 光で照射しました。混合物を、0.1 mM ビオチン-PEG3-アジド (Aladdin、#B122225)、1 mM TCEP、0.1 mM TBTA リガンド、および 1 mM CuSO4 とともに室温で 1 時間、上向きモーションシェーカーでインキュベートしました。スナップ反応の後、4x Laemmli バッファーを混合物に直接加え、95°C で 10 分間沸騰させます。サンプルを SDS-PAGE ゲルで分析し、ストレプトアビジン-HRP (1:1000、Solarbio、#SE068) を使用したウェスタンブロッティングで分析しました。
C 末端アミド化 (LHDALDAK-CONH2) を持つヒスチジン含有合成ペプチドを使用して、近くのペプチドベースの in vitro 標識を分析しました。このアッセイでは、１００μＭの精製ｍｉｎｉＳＯＧ、１０ｍＭのプローブ３、および２μｇ／ｍｌの合成ペプチドを、５０μｌの全反応容量でＰＢＳ中で混合した。反応混合物に青色ＬＥＤ光を室温で１時間照射した。ＬＣ－ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ、ＭａｓｓＬｙｎｘスペクトル分析ソフトウェアを備えたＳＹＮＡＰＴ ＸＳイオン移動度飛行時間型質量分析計）を使用して、１マイクロリットルのサンプルを分析した。
miniSOG 融合遺伝子を安定して発現する HEK293T 細胞を、オルガネラの局在が異なる系統 (Mito、ER、Nucleus) では 10 cm 皿に、Parkin-miniSOG および BRD4-miniSOG 系統では 15 cm 皿に播種しました。約 90% のコンフルエンスに達したら、細胞を HBSS で 1 回洗浄し、プローブ 3 と共に HBSS で 37°C で 1 時間インキュベートし、室温で 10 W の青色 LED で照射しました。パーキンの非接触標識では、HBSS 中のプローブ 3 を含む 10 µM プロトン カルボニル シアニド キャリア m-クロロフェニルヒドラゾン CCCP (Solarbio、#C6700) を 37°C で 1 時間添加しました。細胞溶解、クリックケミストリー、還元およびアルキル化のステップは、2 mg のライセートを添加し、クリック反応で光分解性ビオチンアジドの代わりにビオチン PEG3 アジドを使用したことを除いて、上記と同じでした。濃縮後、ビーズを０．２％ＳＤＳを含む５ｍｌのＰＢＳで３回、１Ｍ尿素を含む５ｍｌのＰＢＳで３回、５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、1 M 尿素を含む 25 mM ABC 300 μl に 2 μg のトリプシンを加え、37°C で一晩タンパク質を切断しました。ｐＨが２～３に達するまでギ酸を添加することにより、反応を停止させた。ビーズをトリプシン処理した後、SOLAµ HRP カラム (Thermo、#60209-001) を使用してペプチド溶液を脱塩し、Speedvac 真空濃縮器で乾燥させました。ペプチドを 0.1% ギ酸に再溶解し、500 ng のペプチドを、上記のナノ ESI ソースを備えた Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計を使用して分析しました。ペプチドは、市販の RP-HPLC プレカラム (75 μm x 2 cm) (Thermo、番号 164946) および分析用 RP-HPLC カラム (75 μm x 25 cm) (Thermo、番号 164941) で分離され、どちらも 2 μm が充填されています。60 分で 8% から 35% ACN へのグラジエント、その後 300 Nl/min の流速で 6 分で 98% B まで直線的に増加します。MS スペクトル (350 ～ 1500 m/z) は、分解能 60,000、AGC 4 × 105、最大入力時間 50 ms で収集されました。選択されたイオンは、正規化された衝突エネルギー 30%、四重極アイソレーション ウィンドウ 1.6 m/z、分解能 15000 で、3 秒サイクルの HCD によって順次フラグメント化されました。5 × 104 タンデム質量分析計 AGC ターゲットと最大注入時間の 22 ミリ秒が使用されました。動的除外は 45 秒に設定されています。 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。 Неназначенные または ионы или ионы с зарядом 1+ または >7+ または для МС/МС. 割り当てられていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。指定されていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で使用されます。指定されていないイオンまたは電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で使用されます。 Неуказанные または ионы или ионы с зарядами 1+ または >7+ または МС/МС. 特定されていないイオン、または電荷が 1+ および >7+ のイオンは、MS/MS で拒否されました。
NeutrAvidin ビーズの濃縮までのサンプル調製ステップは、上記の LC-MS/MS 分析と同じでした。約 50 μg のライセートをローディング コントロールのインプットとして使用し、2 mg のライセートをクリック反応に使用しました。ニュートラアビジンで濃縮および洗浄した後、50μlのLaemmli緩衝液をアガロース樹脂ビーズに添加し、95℃で5分間煮沸することにより、結合したタンパク質を溶出した。コントロールロードインプットとビーズ濃縮サンプルをSDS-PAGEで分析し、標準的なウエスタンブロット法でPVDFメンブレン（Millipore、#ISEQ00010）に転写しました。0.1% tween-20 (TBST) を含む TBS 中の 5% スキムミルク (Sangon、#A600669) で膜をブロックし、一次抗体および二次抗体と順次インキュベートしました。一次抗体を TBST 中の 5% スキムミルクで 1:1000 に希釈し、4°C で一晩インキュベートしました。二次抗体を 1:5000 の比率で使用し、室温で 1 時間インキュベートしました。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰイメージングシステムを使用して、化学発光によって膜を可視化した。図のブロットとゲルのすべてのノーカット スキャンは、生データとして表示されます。
この研究で使用された一次抗体には、ウサギ抗 SFPQ モノクローナル抗体 (CST、番号 71992)、ウサギ抗 FUS モノクローナル抗体 (CST、番号 67840)、ウサギ抗 NSUN2 ポリクローナル抗体 (プロテインテック、番号 20854-1- AP）、ウサギ抗mSin3Aポリクローナル抗体（Abcam、#ab3479）、マウス抗タグモノクローナル抗体（TransGen、#HT201-02）、マウス抗β-アクチンモノクローナル抗体（TransGen、#HC201-01）、ウサギ抗-CDK2モノクローナル抗体(ABclonal、#A0094)、CTBP1に対するウサギモノクローナル抗体(ABclonal、#A11600)、DUTに対するウサギポリクローナル抗体(ABclonal、#A2901)、PSMC4に対するウサギポリクローナル抗体(ABclonal、#A2505)、ウサギ抗- DNAJB1 ポリクローナル抗体 (ABclonal、# A5504)。これらの抗体は、TBST 中の 5% スキムミルクで 1:1000 に希釈して使用しました。この研究で使用した二次抗体には、1:5000 希釈の抗ウサギ IgG (TransGen、#HS101-01)、抗マウス IgG (TransGen、#HS201-01) が含まれていました。
BRD4がSFPQと相互作用するかどうかをさらに調査するために、安定したHEK293TおよびHEK293Tを過剰発現するBRD4-miniSOG細胞を10cmディッシュに播種しました。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤を含む１ｍｌのＰｉｅｒｃｅ ＩＰ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃８７７８７）中で４℃で３０分間溶解した。その後、ライセートを 1.5 ml 遠心管に回収し、4℃で 15,871 xg で 10 分間遠心分離しました。上清を回収し、5 μg の抗 V5 標識マウスモノクローナル抗体 (CST、#80076) とともに 4°C で一晩インキュベートしました。約 50 µl のプロテイン A/G 磁気ビーズ (MCE、#HY-K0202) を 0.5% Tween-20 を含む PBS で 2 回洗浄します。次に、細胞溶解物を磁気ビーズとともに、4℃で4時間、下から上に回転させながらインキュベートしました。次にビーズを１ｍｌのＰＢＳＴ緩衝液で４回洗浄し、９５℃で５分間煮沸した。サンプルを SDS-PAGE ゲルで分析し、標準的なウエスタンブロット法を使用して PVDF 膜に転写しました。メンブレンを TBST 中の 5% スキムミルクでブロックし、一次抗体および二次抗体と順次インキュベートしました。一次抗体 ウサギ抗 SFPQ モノクローナル抗体 (CST、#71992) を TBST 中 5% スキムミルクで 1:1000 の比率で使用し、4°C で一晩インキュベートしました。抗ウサギＩｇＧを１：５０００の比率で使用し、室温で１時間インキュベートした。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰイメージングシステムを使用して、化学発光によって膜を可視化した。
溶媒接触可能表面積 (SASA) 分析に使用されるすべての構造は、Protein Data Bank (PDB)52 または AlphaFold Protein Structure Database53 から取得されました。FreeSASAプログラムを使用して、各残基の絶対SASAを計算しました。各構造の平均SASAを取得するために、標識されたヒスチジンとその近傍の完全で明確なSASAデータのみが使用されました。各ヒスチジンの相対的な溶媒アクセシビリティ (RSA) は、SASA の絶対値を、溶媒が利用できる実験的な最大可能残基表面積で割ることによって計算されました。次に、すべてのヒスチジンは、平均 RSA が 20% 未満の場合は非表示に分類され、それ以外の場合は露出していると分類されました 56。
DDA モードで取得した生ファイルは、Proteome Discoverer (v2.5) または MSfragger (Fragpipe v15.0) を使用して、一般的な汚染物質を含む適切な SwissProt 検証済みタンパク質データベースで検索されました。ペプチドには、2 つの切断部位が欠落している完全なトリプシン、固定修飾としてのカルバモイル メチル化、および動的修飾としてのメチオニン酸化が必要でした。前駆体およびフラグメントの重量許容値は、それぞれ 10 ppm および 0.02 Da (MS2 Orbitrap) に設定されました。 夾雑物ヒットを除去し、タンパク質をフィルター処理して、1% 未満の誤検出率を得ました。 夾雑物ヒットを除去し、タンパク質をフィルター処理して、1% 未満の誤検出率を得ました。 あなたは今、あなたを愛しています、あなたはあなたを愛しています、あなたはあなたを愛しています <1 夾雑物ヒットを除去し、タンパク質をろ過して、誤検出率が 1% 未満になりました。タンパク質を除去して、＜１％の検出率を達成した。 <1% の確率的発見。 1% 未満の場合、1% 未満です。 夾雑物ヒットは除去され、タンパク質はフィルタリングされて、偽陽性率が 1% 未満になりました。ラベルを使用しない定量分析では、3 つの生物学的反復から正規化されたタンパク質含有量が使用されました。タンパク質の細胞内局在解析は、DAVID Bioinformatics Resources、MitoCarta 3.0、および Alice Ting グループによって編集および公開されたデータベースの Gene Ontology (GO) 解析を使用して実行されました。火山マップは Perseus (v1.6.15.0) から取得しました。 両側 t 検定を使用して、タンパク質存在量の倍数変化を統計的有意性についてテストし、存在量の変化が 2 を超え (特に明記しない限り)、p 値が 0.05 未満のタンパク質ヒットを特定しました。 両側 t 検定を使用して、タンパク質存在量の倍数変化を統計的有意性についてテストし、存在量の変化が 2 を超え (特に明記しない限り)、p 値が 0.05 未満のタンパク質ヒットを特定しました。 Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. 両側 t 検定を使用して、タンパク質含有量の倍数変化を統計的有意性についてテストし、タンパク質の一致は、含有量の変化が 2 を超え (特に明記しない限り)、p 値が 0.05 未満であると特定されました。双変量検定を用いて、タンパク質の倍数変化の詳細な変化を調べ、タンパク質命中の変化量が> 2（特別な説明がない場合を除く）およびp値<0.05であることを確認した。双 t 検定を使用して、タンパク質の倍数変化の詳細な統計的変動を調べ、タンパク質命中の糖度の変化 > 2 (説明あり) および p 値 <0.05 を確認しました。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. 両側 t 検定を使用して、タンパク質含有量の倍数変化の統計的有意性をテストし、含有量の変化が 2 を超える場合 (特に明記しない限り)、p 値が 0.05 未満の場合に、タンパク質の一致を決定しました。タンパク質相互作用分析は、GO分析とStringデータベースを使用して実行されました。
3 つの生物学的複製が実行され、同様の結果が得られました。統計分析は GraphPad Prism (GraphPad ソフトウェア) で行い、火山プロットは Perseus (v1.6.15.0) で生成しました。2 つのグループを比較するために、スチューデントの両側 t 検定を使用して p 値を決定しました。実験グループで少なくとも 2 回識別されたシングルトン タンパク質のみが火山プロットに含まれ、対照グループの対応する欠損値は、p 値を計算できるように正規分布からペルセウスに置き換えられました。誤差範囲は、平均 ± 標準偏差を表します。統計分析のためのプロテオミクス分析では、少なくとも 2 つの生物学的複製に出現したタンパク質の存在量が保持されました。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。実験はランダムではありません。研究者は、実験と結果の評価中のタスクに盲目ではありませんでした。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research Report の要約を参照してください。
この研究で得られた質量分析データは、データセット ID PXD034811 (PDPL-MS データセット) で iProX57 パートナー リポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに提出されました。生データは、生データ ファイルの形式で提供されます。この記事では、元のデータを提供します。
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 近所を知る: 近接依存性ビオチン化を使用してタンパク質複合体を特徴付け、オルガネラをマッピングします。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 近所を知る: 近接依存性ビオチン化を使用してタンパク質複合体を特徴付け、オルガネラをマッピングします。Gingras, AS, Abe, KT および Raut, B. 環境への精通: 近接依存性ビオチン化を使用してタンパク質複合体を特徴付け、オルガネラをマップします。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解: 近距離生物素化を用いてタンパク質複合体を発現させ、細胞図を作成した。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 近隣を理解する: 近隣が生物学的生命に依存していることを利用する。Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. 近接性を理解する: タンパク質複合体の特徴付けと、近接依存性ビオチン化を使用したオルガネラのマッピング。現時点の。私の意見。化学。生物学 48、44–54 (2019)。
ゲリ、JBら。デクスターのエネルギーを免疫細胞に伝達することにより、微小環境をマッピングします。サイエンス 367, 1091–1097 (2020).
Hertling、EL等。2 つのプロテオーム スケールのネットワークは、ヒト インタラクトームの細胞特異的なリモデリングを検出します。セル 184、3022–3040.e3028 (2021)。
投稿時間: Sep-15-2022
