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効果的な光増感剤は、光線療法の広範な臨床使用にとって特に重要です。ただし、従来の光増感剤は一般に、短波長吸収、不十分な光安定性、活性酸素種 (ROS) の低い量子収率、および ROS の凝集誘起消光に悩まされています。ここでは、近赤外 (NIR) 超分子光増感剤 (RuDA) を介した Ru (II)-アレーン有機金属錯体の水溶液中の自己組織化を報告します。RuDA は凝集状態で一重項酸素 (1O2) のみを生成でき、一重項-三重項系間のクロスオーバー プロセスが大幅に増加するため、凝集によって誘導される明らかな 1O2 生成動作を示します。808 nm レーザー光の作用下で、RuDA は 16.4% の 1O2 量子収率 (FDA 承認のインドシアニン グリーン: ΦΔ=0.2%) と 24.2% の高い光熱変換効率 (市販の金ナノロッド) を示し、優れた光安定性を備えています。: 21.0%、金ナノシェル: 13.0%)。さらに、良好な生体適合性を持つ RuDA NPs は優先的に腫瘍部位に蓄積することができ、in vivo での腫瘍体積が 95.2% 減少し、光線力学療法中に有意な腫瘍退縮を引き起こします。この凝集増強光力学療法は、好ましい光物理的および光化学的特性を備えた光増感剤を開発するための戦略を提供します。
従来の治療法と比較して、光線力学療法 (PDT) は、正確な時空間制御、非侵襲性、ごくわずかな薬剤耐性、および副作用の最小化などの重要な利点により、がんの魅力的な治療法です 1、2、3。光照射下で、使用される光増感剤が活性化されて高活性酸素種 (ROS) を形成し、アポトーシス/ネクローシスまたは免疫応答を引き起こします4,5。 しかし、クロリン、ポルフィリン、アントラキノンなどのほとんどの従来の光増感剤は、比較的短波長の吸収 (周波数 < 680 nm) を持っているため、生体分子 (ヘモグロビンやメラニンなど) の吸収が強いため、光の透過性が低下します。可視領域6,7。 しかし、クロリン、ポルフィリン、アントラキノンなどのほとんどの従来の光増感剤は、比較的短波長の吸収 (周波数 < 680 nm) を持っているため、生体分子 (ヘモグロビンやメラニンなど) の吸収が強いため、光の透過性が低下します。可視領域6,7。 Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. しかし、クロリン、ポルフィリン、アントラキノンなどの最も一般的な光増感剤は、吸収波長が比較的短く (< 680 nm)、生体分子 (ヘモグロビンやメラニンなど) が可視領域に強く吸収されるため、光の透過が不十分になります6,7。しかし、ほとんどの伝達された光感受性物質、例えばジオキシダント、リン、リンなどは、比較的短い波長吸収 (波長 < 680 nm) を持っています。その結果、光透過性が低下します。しかし、ほとんどの光感受性物質である二価リン、リンリンは、比較的短波長の吸収（波長率<680 nm）を持っています。吸収 吸収 吸収 吸収 吸収 HIは、光透過性を低下させる。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. ただし、クロリン、ポルフィリン、アントラキノンなどのほとんどの従来の光増感剤は、ヘモグロビンやメラニンなどの生体分子の強い吸収により、光の浸透が不十分になるため、吸収波長が比較的短くなっています (周波数 < 680 nm)。可視領域 6.7.したがって、700 ～ 900 nm の「治療ウィンドウ」で活性化される近赤外線 (NIR) 吸収光増感剤は、光線療法に適しています。近赤外光は生体組織による吸収が最も少ないため、より深く浸透し、光損傷を少なくすることができます8,9。
残念なことに、既存の NIR 吸収光増感剤は、一般的に光安定性が低く、一重項酸素 (1O2) 生成能力が低く、凝集による 1O2 消光があり、臨床応用が制限されます 10,11。従来の光増感剤の光物理的および光化学的特性を改善するために多大な努力が払われてきましたが、これまでのところ、近赤外吸収光増感剤がこれらすべての問題を解決できることがいくつかの報告で報告されています。さらに、いくつかの光増感剤は、800 nm 以上の光を照射すると 1O212,13,14 を効率的に生成する可能性を示しています。電子供与体としてのトリフェニルアミン (TFA) および電子受容体基としての [1,2,5] チアジアゾール-[3,4-i] ジピリド [a,c] フェナジン (TDP) 供与体受容体 (DA) タイプの染色近赤外線を吸収する染料の 、バンドギャップが狭いため、近赤外線バイオイメージングIIおよび光熱療法（PTT）について広く研究されています。したがって、DA 型色素は近赤外励起の PDT に使用できますが、PDT の光増感剤としてはほとんど研究されていません。
光増感剤の項間交差 (ISC) の高効率が 1O2 の形成を促進することはよく知られています。ISC プロセスを進めるための一般的な戦略は、重原子または特別な有機部分を導入することにより、光増感剤のスピン軌道結合 (SOC) を強化することです。ただし、このアプローチにはまだいくつかの欠点と制限があります19,20。最近、超分子の自己組織化は、分子レベルで機能性材料を製造するためのボトムアップのインテリジェントなアプローチを提供しており 21,22 、光線療法に多くの利点があります。(1)自己組織化された光増感剤は、リボン構造を形成する可能性があります。ビルディングブロック間の軌道の重なりによるエネルギーレベルのより密な分布を持つ電子構造に似ています。したがって、下側の一重項励起状態 (S1) と隣接する三重項励起状態 (Tn) の間のエネルギー マッチが改善され、ISC プロセスにとって有益です 23, 24 。(2) 超分子集合体は、ISC プロセスも促進する分子内運動制限メカニズム (RIM) に基づいて非放射緩和を減少させます 25, 26 。(3) 超分子集合体は、モノマーの内部分子を酸化や劣化から保護し、それによって光増感剤の光安定性を大幅に改善します。上記の利点を考えると、超分子光増感剤システムは、PDT の欠点を克服するための有望な代替手段になり得ると考えています。
Ru (II) ベースの複合体は、そのユニークで魅力的な生物学的特性により、疾患の診断と治療における潜在的なアプリケーションのための有望な医療プラットフォームです。さらに、Ru(II) ベースの錯体の豊富な励起状態と調整可能な光物理化学的特性は、Ru (II) ベースの光増感剤の開発に大きな利点を提供します。注目すべき例は、ルテニウム (II) ポリピリジル複合体 TLD-1433 で、現在、非筋層浸潤性膀胱癌 (NMIBC) の治療のための光増感剤として第 II 相臨床試験が行われています 41。さらに、ルテニウム (II) アレーン有機金属錯体は、毒性が低く、変更が容易なため、癌治療の化学療法剤として広く使用されています42,43,44,45。Ru(II)-アレーン有機金属錯体のイオン特性は、一般的な溶媒への DA 発色団の溶解度の低さを改善するだけでなく、DA 発色団の集合も改善します。さらに、Ru(II)-アレーンの有機金属錯体の疑似八面体半サンドイッチ構造は、DA 型発色団の H 凝集を立体的に防止し、それによって赤方偏移した吸収帯を持つ J 凝集の形成を促進します。ただし、低安定性および/またはバイオアベイラビリティの低さなど、Ru(II)-アレーン錯体の固有の欠点は、アレーン-Ru(II)錯体の治療効果および生体内活性に影響を与える可能性があります。しかし、物理的カプセル化または共有結合によってルテニウム錯体を生体適合性ポリマーでカプセル化することにより、これらの欠点を克服できることが研究により示されています。
この作業では、DAD 発色団と Ru(II)-アレーン部分との間の配位結合を介した NIR トリガーを使用した、Ru(II)-アレーン (RuDA) の DA 共役複合体を報告します。得られた複合体は、非共有相互作用により、水中でメタロ超分子ベシクルに自己集合できます。特に、超分子集合体はRuDAに重合誘導系間交差特性を付与し、ISC効率を大幅に向上させ、PDTに非常に有利でした（図1A）。腫瘍の蓄積と in vivo 生体適合性を高めるために、FDA 承認の Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) を使用して RuDA47,48,49 をカプセル化し、非常に効率的な PDT/デュアルとして機能する RuDA-NP ナノ粒子 (図 1B) を作成しました。モード PTT プロキシ。癌の光線療法 (図 1C) では、RuDA-NP を使用してヌードマウスを MDA-MB-231 腫瘍で治療し、in vivo での PDT および PTT の有効性を調べました。
癌の光線療法、NIR 活性化 PDT および PTT 用の B RuDA-NP および C RuDA-NP の合成のための単量体および凝集形態の RuDA の光物理学的メカニズムの概略図。
TPA および TDP 機能で構成される RuDA は、補足図 1 (図 2A) に示す手順に従って調製され、RuDA は 1H および 13C NMR スペクトル、エレクトロスプレーイオン化質量分析、および元素分析 (補足図 2-4 ）。最低一重項遷移の RuDA 電子密度差マップは、時間依存密度汎関数理論 (TD-DFT) によって計算され、電荷移動プロセスが研究されました。補足図5に示すように、電子密度は、光励起後に主にトリフェニルアミンからTDPアクセプターユニットにドリフトします。これは、典型的な分子内電荷移動(CT)遷移に起因する可能性があります。
鉱石の化学構造 B さまざまな比率の DMF と水の混合物中の鉱石の吸収スペクトル。C 808 nm レーザー光の 0.5 W cm-2 での時間に対する RuDA (800 nm) および ICG (779 nm) の正規化された吸収値。D ABDA の光分解は、波長 808 nm、出力 0.5 W/cm2 のレーザー放射の作用下で、水の含有量が異なる DMF/H2O 混合物中で RuDA が誘導する 1O2 の形成によって示されます。
要約 - 紫外可視吸収分光法を使用して、さまざまな比率の DMF と水の混合物中の鉱石の自己組織化特性を調べました。図に示すように。図２Ｂにおいて、ＲｕＤＡはＤＭＦ中で６００から９００ｎｍの吸収帯を示し、７２９ｎｍに最大吸収帯を有する。水の量を増やすと、鉱石の最大吸収が 800 nm まで徐々に赤方偏移しました。これは、組み立てられたシステムでの鉱石の J 凝集を示しています。さまざまな溶媒中の RuDA のフォトルミネッセンス スペクトルを補足図 6 に示します。それぞれ、CH2Cl2 および CH3OH で 1050 nm。RuDA の大きなストークス シフト (約 300 nm) は、励起状態のジオメトリの大幅な変化と低エネルギー励起状態の形成を示しています。CH2Cl2 および CH3OH 中の鉱石のルミネッセンス量子収率は、それぞれ 3.3 および 0.6% であると決定されました。ただし、メタノールと水の混合物 (5/95、v/v) では、発光のわずかな赤方偏移と量子収率の減少 (0.22%) が観察されました。これは、鉱石の自己組織化による可能性があります。 .
ORE の自己組織化を視覚化するために、液体原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して、水を加えた後のメタノール溶液中の ORE の形態変化を視覚化しました。水分含有量が80％未満の場合、明確な凝集は観察されませんでした（補足図7）。しかし、水分含有量が 90 ～ 95% にさらに増加すると、小さなナノ粒子が現れ、鉱石の自己組織化が示されました。さらに、波長 808 nm のレーザー照射は、水溶液中の RuDA の吸収強度に影響しませんでした。ソリューション（図2Cおよび補足図8）。対照的に、インドシアニン グリーン (コントロールとして ICG) の吸光度は 779 nm で急速に低下し、RuDA の優れた光安定性を示しています。さらに、PBS (pH = 5.4、7.4、および 9.0)、10% FBS、および DMEM (高グルコース) 中の RuDA-NP の安定性を、さまざまな時点での紫外可視吸収分光法によって調べました。補足図9に示すように、RuDA-NP吸収バンドのわずかな変化がpH 7.4/9.0のPBS、FBS、およびDMEMで観察され、RuDA-NPの優れた安定性を示しています。しかし、酸性媒体 (ρ = 5.4) では、鉱石の加水分解が見られました。また、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) メソッドを使用して、RuDA および RuDA-NP の安定性をさらに評価しました。補足図 10 に示すように、RuDA は最初の 1 時間はメタノールと水の混合物 (50/50、v/v) で安定しており、4 時間後には加水分解が観察されました。ただし、RuDA NP では広い凹凸ピークのみが観察されました。したがって、ゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) を使用して、PBS (pH = 7.4) 中の RuDA NP の安定性を評価しました。補足図 11 に示すように、テスト条件下で 8 時間のインキュベーション後、NP RuDA のピーク高さ、ピーク幅、およびピーク面積は大幅に変化せず、NP RuDA の優れた安定性を示しています。さらに、TEM画像は、RuDA-NPナノ粒子の形態が、希釈PBSバッファーで24時間後も実質的に変化していないことを示しました（pH = 7.4、補足図12）。
自己組織化は鉱石にさまざまな機能的および化学的特性を与える可能性があるため、メタノールと水の混合物で9,10-アントラセンジイルビス（メチレン）ジマロン酸（ABDA、インジケーター1O2）の放出が観察されました。水分含有量の異なる鉱石50.図 2D および補足図 13 に示すように、水分含有量が 20% 未満の場合、ABDA の分解は観察されませんでした。湿度が 40% に上昇すると、ABDA の蛍光強度が低下することから明らかなように、ABDA の劣化が発生しました。また、水分含有量が高いほど分解が速くなることが観察されており、RuDAの自己組織化が必要であり、ABDAの分解に有益であることを示唆しています。この現象は、最新の ACQ (凝集誘起消光) 発色団とは大きく異なります。波長 808 nm のレーザーを照射した場合、98% H2O/2% DMF の混合物中の 1O2 RuDA の量子収率は 16.4% であり、これは ICG の 82 倍 (ΦΔ = 0.2%)51、凝集状態の 1O2 RuDA で顕著な生成効率を示します。
スピン トラップとして 2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジノン (TEMP) および 5,5-ジメチル-1-ピロリン N-オキシド (DMPO) を使用した電子スピンAFK。ルダによる。補足図 14 に示すように、照射時間 0 ～ 4 分で 1O2 が生成されることが確認されています。さらに、RuDA を DMPO と照射下でインキュベートすると、1:2:2:1 DMPO-OH·付加物の典型的な 4 ライン EPR シグナルが検出され、ヒドロキシルラジカル (OH·) の形成が示されました。全体として、上記の結果は、二重タイプ I/II 光増感プロセスを通じて ROS 産生を刺激する RuDA の能力を示しています。
単量体および凝集形態の RuDA の電子特性をよりよく理解するために、DFT 法を使用して、単量体および二量体形態の RuDA のフロンティア分子軌道を計算しました。図に示すように。図３Ａにおいて、単量体ＲｕＤＡの最高占有分子軌道（ＨＯＭＯ）は配位子主鎖に沿って非局在化し、最低空分子軌道（ＬＵＭＯ）はＴＤＰアクセプターユニットの中心にある。逆に、二量体 HOMO の電子密度は 1 つの RuDA 分子の配位子に集中していますが、LUMO の電子密度は主に別の RuDA 分子のアクセプター ユニットに集中しており、これは RuDA が二量体にあることを示しています。CTの特徴。
A 鉱石の HOMO と LUMO は、単量体と二量体で計算されます。B 単量体および二量体における鉱石の一重項および三重項エネルギー準位。C 単量体 C および二量体 D としての RuDA および可能な ISC チャネルの推定レベル。矢印は可能な ISC チャネルを示します。
単量体および二量体のRuDAの低エネルギー一重項励起状態における電子と正孔の分布は、TD-DFT法を使用して計算されたMultiwfn 3.852.53ソフトウェアを使用して分析されました。追加のラベルに示されているとおりです。図 1 ～ 2 に示すように、単量体 RDA ホールは、これらの一重項励起状態では配位子骨格に沿ってほとんど非局在化されていますが、電子はほとんど TDP グループに位置しており、CT の分子内特性を示しています。さらに、これらの一重項励起状態では、正孔と電子の間に多かれ少なかれ重なりがあり、これらの一重項励起状態が局所励起 (LE) から何らかの寄与をしていることを示唆しています。二量体の場合、分子内 CT および LE 機能に加えて、分子間 CT 分析に基づいて、それぞれの状態、特に S3、S4、S7、および S8 で特定の割合の分子間 CT 機能が観察され、CT 分子間遷移が主なものでした。 (補足表)。3)。
実験結果をよりよく理解するために、RuDA励起状態の特性をさらに調査して、モノマーとダイマーの違いを調査しました（補足表4〜5）。図 3B に示すように、二量体の一重項および三重項励起状態のエネルギー レベルは、単量体のエネルギー レベルよりもはるかに高密度であり、S1 と Tn の間のエネルギー ギャップを減らすのに役立ちます。 ISC 遷移は、S1 と Tn の間の小さなエネルギーギャップ (ΔES1-Tn < 0.3 eV) 内で実現できることが報告されています54。 ISC 遷移は、S1 と Tn の間の小さなエネルギーギャップ (ΔES1-Tn < 0.3 eV) 内で実現できることが報告されています54。 S1 と Tn54 の組み合わせで、ISC は 2 番目のバージョンで使用されます。 ISC 遷移は、S1 と Tn の間の小さなエネルギーギャップ (ΔES1-Tn <0.3 eV) 内で実現できることが報告されています54。したがって、ISC は、S1 と Tn54 の間のわずかなエネルギー ギャップ (ΔES1-Tn < 0.3 eV) 内で実現することができます。したがって、ISC は、S1 と Tn54 の間のわずかなエネルギー ギャップ (ΔES1-Tn < 0.3 eV) 内で実現することができます。 S1 と Tn54 の組み合わせで ISC が使用されています。 ISC 遷移は、S1 と Tn の間の小さなエネルギーギャップ (ΔES1-Tn < 0.3 eV) 内で実現できることが報告されています54。さらに、占有または非占有の 1 つの軌道のみが、非ゼロの SOC 積分を提供するために、束縛された一重項と三重項の状態が異なる必要があります。したがって、励起エネルギーと軌道遷移の分析に基づいて、ISC遷移のすべての可能なチャネルが図1と図2に示されています。3C、D。特に、単量体では 1 つの ISC チャネルしか利用できませんが、二量体には ISC 遷移を促進できる 4 つの ISC チャネルがあります。したがって、RuDA 分子が凝集すればするほど、ISC チャネルへのアクセスが容易になると考えるのが妥当です。したがって、RuDA 凝集体は一重項状態と三重項状態で 2 バンドの電子構造を形成し、S1 と利用可能な Tn の間のエネルギーギャップを減らし、それによって ISC の効率を高めて 1O2 生成を促進することができます。
根底にあるメカニズムをさらに解明するために、RuDAの2つのエチル基を2つのトリフェニルアミンフェニル基に置き換えることにより、アレーン-Ru（II）錯体（RuET）の参照化合物を合成しました（図4A、完全な特徴付けについては、ESI、補足15を参照） -21 ) ドナー (ジエチルアミン) からアクセプター (TDF) まで、RuET は RuDA と同じ分子内 CT 特性を持っています。予想どおり、DMF 中の RuET の吸収スペクトルは、600 ～ 1100 nm の領域の近赤外領域に強い吸収を持つ低エネルギー電荷移動バンドを示しました (図 4B)。さらに、水分含有量の増加に伴ってRuET凝集も観察され、これは吸収極大の赤方偏移に反映され、液体AFMイメージングによってさらに確認されました（補足図22）。この結果は、RuDA と同様に、RuET が分子内状態を形成し、自己組織化して凝集構造を形成できることを示しています。
RuET の化学構造。B さまざまな比率の DMF と水の混合物中の RuET の吸収スペクトル。RuDA と RuET の C EIS ナイキストをプロットします。808 nm の波長のレーザー放射の作用下での RuDA および RuET の光電流応答 D。
RuETの存在下でのABDAの光分解は、波長808 nmのレーザーを照射することによって評価されました。驚くべきことに、さまざまな水画分でABDAの分解は観察されませんでした（補足図23）。考えられる理由は、エチル鎖が効率的な分子間電荷移動を促進しないため、RuET がバンド電子構造を効率的に形成できないことです。したがって、電気化学インピーダンス分光法 (EIS) と過渡光電流測定を実行して、RuDA と RuET の光電気化学特性を比較しました。ナイキスト線図 (図 4C) によると、RuDA は RuET よりもはるかに小さい半径を示しています。これは、RuDA56 がより高速な分子間電子輸送と優れた伝導性を備えていることを意味します。さらに、RuDA の光電流密度は RuET の光電流密度よりもはるかに高く (図 4D)、RuDA57 の電荷移動効率が優れていることが確認されました。このように、Ore のトリフェニルアミンのフェニル基は、分子間電荷移動と帯状の電子構造の形成において重要な役割を果たします。
腫瘍の蓄積と in vivo 生体適合性を高めるために、RuDA を F127 でさらにカプセル化しました。RuDA-NP の平均流体力学的直径は、動的光散乱 (DLS) 法 (図 5A) を使用して狭い分布 (PDI = 0.089) で 123.1 nm であると決定され、透過性と保持を増加させることによって腫瘍の蓄積を促進しました。EPR)効果。TEM 画像は、鉱石 NP が平均直径 86 nm の均一な球形であることを示しました。特に、RuDA-NPの吸収極大は800 nmに現れ（補足図24）、RuDA-NPが自己組織化RuDAの機能と特性を保持している可能性があることを示しています。NP Ore の計算された ROS 量子収率は 15.9% で、これは Ore に匹敵します。RuDA NP の光熱特性は、赤外線カメラを使用して 808 nm の波長のレーザー放射の作用下で研究されました。図に示すように。図 5B、C では、コントロール グループ (PBS のみ) では温度がわずかに上昇しましたが、RuDA-NPs 溶液の温度は、温度 (ΔT) が 15.5、26.1、および 43.0°C に上昇するにつれて急速に上昇しました。高濃度はそれぞれ 25、50、および 100 μM であり、RuDA NP の強い光熱効果を示しています。さらに、RuDA-NP の光熱安定性を評価し、ICG と比較するために、加熱/冷却サイクル測定が行われました。鉱石NPの温度は、5回の加熱/冷却サイクル後も低下しませんでした（図5D）。これは、鉱石NPの優れた光熱安定性を示しています。対照的に、同じ条件下での光熱温度プラトーの明らかな消失からわかるように、ICGはより低い光熱安定性を示します。以前の方法によると 58、RuDA-NP の光熱変換効率 (PCE) は 24.2% と計算され、これは金ナノロッド (21.0%) や金ナノシェル (13.0%) などの既存の光熱材料よりも高くなっています 59 。このように、NP 鉱石は優れた光熱特性を示し、有望な PTT 剤となります。
RuDA NP の DLS および TEM 画像の解析 (挿入図)。B 波長 808 nm (0.5 W cm-2) のレーザー放射にさらされたさまざまな濃度の RuDA NP の熱画像。C さまざまな濃度の鉱石 NP の光熱変換曲線。定量データです。B. D 5 加熱冷却サイクルにわたる ORE NP と ICG の温度上昇。
MDA-MB-231 ヒト乳癌細胞に対する RuDA NP の光細胞毒性を in vitro で評価しました。図に示すように。図６Ａ、Ｂ、ＲｕＤＡ－ＮＰおよびＲｕＤＡは、照射の非存在下で無視できる程度の細胞毒性を示し、ＲｕＤＡ－ＮＰおよびＲｕＤＡのより低い暗毒性を示唆している。しかし、808 nm の波長のレーザー放射に曝露した後、RuDA および RuDA NP は、MDA-MB-231 がん細胞に対して、それぞれ 5.4 および 9.4 μM の IC50 値 (最大阻害濃度の半分) で強い光細胞毒性を示し、 RuDA-NP と RuDA は癌の光線療法の可能性を秘めている。さらに、RuDA-NP および RuDA の光細胞毒性は、ROS スカベンジャーであるビタミン C (Vc) の存在下でさらに調査され、光誘導細胞毒性における ROS の役割を解明しました。明らかに、細胞生存率は Vc の添加後に増加し、RuDA および RuDA NP の IC50 値はそれぞれ 25.7 および 40.0 μM であり、RuDA および RuDA NP の光細胞毒性における ROS の重要な役割を証明しています。カルセイン AM (生細胞の緑色蛍光) およびヨウ化プロピジウム (PI、死細胞の赤色蛍光) を使用した生/死細胞染色による、MDA-MB-231 癌細胞における RuDA-NP および RuDA の光誘導細胞毒性。細胞によって確認された）蛍光プローブとして。図 6C に示すように、RuDA-NP または RuDA で処理した細胞は、強い緑色の蛍光によって証明されるように、照射なしで生存したままでした。それどころか、レーザー照射下では、赤色蛍光のみが観察され、RuDA または RuDA NP の効果的な光細胞毒性が確認されました。Vc を添加すると緑色の蛍光が現れたことは注目に値します。これは、RuDA および RuDA NP の光細胞毒性に違反していることを示しています。これらの結果は、in vitro 光細胞毒性アッセイと一致しています。
それぞれ Vc (0.5 mM) の存在下または非存在下での MDA-MB-231 細胞における A RuDA- および B RuDA-NP 細胞の用量依存的な生存率。エラーバー、平均 ± 標準偏差 (n = 3)。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。C 蛍光プローブとしてカルセイン AM とヨウ化プロピジウムを使用した生/死細胞染色分析。スケール バー: 30 μ m。各グループからの 3 つの生物学的反復の代表的な画像が表示されます。D 異なる処理条件下での MDA-MB-231 細胞における ROS 産生の共焦点蛍光画像。緑色の DCF 蛍光は、ROS の存在を示します。波長 808 nm のレーザーを 0.5 W/cm2 の出力で 10 分間 (300 J/cm2) 照射します。スケール バー: 30 μ m。各グループからの 3 つの生物学的反復の代表的な画像が表示されます。E フローサイトメトリー RuDA-NPs (50 μM) または RuDA (50 μM) 処理分析 (808 nm レーザー (0.5 W cm-2) の有無にかかわらず、Vc (0.5 mM) の存在下および非存在下で 10 分間)。各グループからの 3 つの生物学的反復の代表的な画像が表示されます。808 nm レーザー照射 (0.5 W cm-2、10 分、300 J cm-2) の有無にかかわらず、RuDA-NP (50 μM) で処理した MDA-MB-231 細胞の F Nrf-2、HSP70 および HO-1、細胞発現 2)。各グループからの 2 つの生物学的反復の代表的な画像が表示されます。
MDA-MB-231細胞における細胞内ROS産生は、2,7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色法を用いて調べた。図に示すように。6D、RuDA-NP または RuDA で処理した細胞は、808 nm レーザーを照射すると明確な緑色の蛍光を示し、RuDA-NP および RuDA が ROS を生成する効率的な能力を持っていることを示しています。それどころか、光の非存在下または Vc の存在下では、細胞の弱い蛍光シグナルのみが観察され、ROS のわずかな形成が示されました。RuDA-NP細胞およびRuDA処理MDA-MB-231細胞の細胞内ROSレベルは、フローサイトメトリーによってさらに決定されました。補足図 25 に示すように、808 nm レーザー照射下で RuDA-NP および RuDA によって生成された平均蛍光強度 (MFI) は、対照群と比較して、それぞれ約 5.1 倍および 4.8 倍大幅に増加し、AFK の優れた形成が確認されました。容量。ただし、RuDAで処理したRuDA-NPまたはMDA-MB-231細胞の細胞内ROSレベルは、共焦点蛍光分析の結果と同様に、レーザー照射なしまたはVcの存在下でのコントロールにのみ匹敵しました。
ミトコンドリアが Ru(II)-アレーン複合体の主な標的であることが示されています60。したがって、RuDA および RuDA-NP の細胞内局在を調査しました。補足図 26 に示すように、RuDA と RuDA-NP は、ミトコンドリアでの蓄積が最も高い同様の細胞分布プロファイルを示します (それぞれ 62.5 ± 4.3 および 60.4 ± 3.6 ng/mg タンパク質)。ただし、鉱石と NP 鉱石の核画分には少量の Ru しか見つかりませんでした (それぞれ 3.5% と 2.1%)。残りの細胞画分には残留ルテニウムが含まれていました。RuDA では 31.7% (30.6 ± 3.4 ng/mg タンパク質)、RuDA-NP では 42.9% (47.2 ± 4.5 ng/mg タンパク質) でした。一般的に鉱石やNP鉱石は主にミトコンドリアに蓄積されます。ミトコンドリア機能障害を評価するために、JC-1 および MitoSOX Red 染色を使用して、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシド産生能力をそれぞれ評価しました。補足図27に示すように、808 nmレーザー照射下でRuDAとRuDA-NPの両方で処理した細胞で強い緑色（JC-1）と赤色（MitoSOX Red）の蛍光が観察され、RuDAとRuDA-NPの両方が高度に蛍光性であることを示していますミトコンドリア膜の脱分極とスーパーオキシド産生を効果的に誘導できます。さらに、細胞死のメカニズムは、フローサイトメトリーに基づくアネキシン V-FITC/ヨウ化プロピジウム (PI) の分析を使用して決定されました。図 6E に示すように、808 nm レーザーを照射すると、RuDA および RuDA-NP は、PBS または PBS とレーザーと比較して、MDA-MB-231 細胞の早期アポトーシス率 (右下象限) を大幅に増加させました。処理された細胞。ただし、Vc を追加すると、RuDA と RuDA-NP のアポトーシス率はそれぞれ 50.9% と 52.0% から 15.8% と 17.8% に大幅に減少し、RuDA と RuDA-NP の光細胞毒性における ROS の重要な役割が確認されました。.さらに、テストしたすべてのグループでわずかな壊死細胞が観察され（左上象限）、アポトーシスがRuDAおよびRuDA-NPによって誘導される細胞死の主な形態である可能性があることを示唆しています。
酸化ストレスによる損傷はアポトーシスの主要な決定因子であるため、抗酸化システムの重要な調節因子である赤血球 2、第 2 因子 (Nrf2) 62 に関連する核因子を、RuDA-NP で処理した MDA-MB-231 で調査しました。照射によって誘導されるRuDA NPの作用機序。同時に、下流のタンパク質ヘムオキシゲナーゼ 1 (HO-1) の発現も検出されました。図 6F および補足図 29 に示すように、RuDA-NP を介した光線療法は、PBS グループと比較して Nrf2 および HO-1 の発現レベルを増加させ、RuDA-NP が酸化ストレスシグナル伝達経路を刺激する可能性があることを示しています。さらに、RuDA-NPs63 の光熱効果を研究するために、熱ショックタンパク質 Hsp70 の発現も評価しました。RuDA-NP + 808 nm レーザー照射で処理した細胞は、他の 2 つのグループと比較して Hsp70 の発現増加を示し、高体温に対する細胞応答を反映していることは明らかです。
顕著な in vitro の結果により、MDA-MB-231 腫瘍を有するヌードマウスにおける RuDA-NP の in vivo 性能を調査するようになりました。RuDA NP の組織分布は、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、肺、および腫瘍におけるルテニウムの含有量を測定することによって研究されました。図に示すように。図７Ａに示すように、正常器官における鉱石ＮＰの最大含有量は、最初の観察時間（４時間）に現れたが、最大含有量は、おそらく鉱石ＮＰのために、注射の８時間後に腫瘍組織において決定された。LFのEPR効果。分布の結果によると、NP 鉱石による最適な治療期間は、投与後 8 時間でした。腫瘍部位におけるRuDA-NPの蓄積のプロセスを説明するために、RuDA-NPの光音響(PA)特性を、注射後の異なる時間にRuDA-NPのPA信号を記録することによってモニターした。まず、RuDA-NP の腫瘍内注射後に腫瘍部位の PA 画像を記録することにより、in vivo での RuDA-NP の PA シグナルを評価しました。補足図 30 に示すように、RuDA-NP は強い PA シグナルを示し、RuDA-NP 濃度と PA シグナル強度の間には正の相関がありました (補足図 30A)。次に、注射後の異なる時点でのRuDAおよびRuDA-NPの静脈内注射後に、腫瘍部位のin vivo PA画像を記録しました。図 7B に示すように、腫瘍部位からの RuDA-NP の PA シグナルは時間とともに徐々に増加し、注射後 8 時間でプラトーに達しました。これは、ICP-MS 分析によって決定された組織分布の結果と一致しています。ＲｕＤＡに関して（補足図３０Ｂ）、注射の４時間後に最大のＰＡ信号強度が現れ、腫瘍へのＲｕＤＡの急速な進入率を示した。さらに、ICP-MS を使用して尿および糞便中のルテニウムの量を測定することにより、RuDA および RuDA-NP の排泄挙動を調べました。RuDA (補足図 31) および RuDA-NP (図 7C) の主な排泄経路は糞便によるものであり、8 日間の研究期間中に RuDA および RuDA-NP の効果的なクリアランスが観察されました。また、RuDA-NP は、長期的な毒性なしに体内から効率的に除去される可能性があります。
A. マウス組織における RuDA-NP の ex vivo 分布は、注入後のさまざまな時点での Ru 含有量 (組織 1 グラムあたりの Ru の投与量 (ID) の割合) によって決定されました。データは平均 ± 標準偏差 (n = 3) です。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。B 異なる時点での RuDA-NP (10 μmol kg-1) の静脈内投与後の 808 nm 励起での in vivo 腫瘍部位の PA 画像。RuDA NP (10 µmol kg-1) の静脈内投与後、C Ru はマウスから尿と糞便とともに異なる時間間隔で排泄されました。データは平均 ± 標準偏差 (n = 3) です。
インビボでのＲｕＤＡ－ＮＰの加熱能力は、比較のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＲｕＤＡ腫瘍を有するヌードマウスで研究された。図に示すように。図８Ａおよび補足図３２において、対照（生理食塩水）群は、１０分間の連続曝露後、温度変化が少ない（ΔＴ≒３℃）ことを示した。ただし、RuDA-NP と RuDA の温度はそれぞれ 55.2 と 49.9 °C の最高温度で急速に上昇し、in vivo がん治療に十分な温熱療法を提供しました。RuDA (ΔT ≈ 19°C) と比較して、RuDA NP で観測された高温の上昇 (ΔT ≈ 24°C) は、EPR 効果による腫瘍組織への透過性と蓄積の向上による可能性があります。
MDA-MB-231 腫瘍を有するマウスの赤外線熱画像。注射の 8 時間後に 808 nm レーザーを異なる時間に照射。各グループからの 4 つの生物学的反復の代表的な画像が表示されます。B 相対腫瘍体積および C 治療中のマウスの異なる群の平均腫瘍質量。D マウスの異なるグループの体重の曲線。波長 808 nm のレーザーを 0.5 W/cm2 の出力で 10 分間 (300 J/cm2) 照射します。エラーバー、平均 ± 標準偏差 (n = 3)。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 対応のない両側 t 検定 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。未対応の双生児検出*p < 0.05、**p < 0.01および***p < 0.001。 *p <0,05, **p <0,01 および ***p <0,001. 対応のない両側 t 検定 *p<0.05、**p<0.01、および ***p<0.001。 生理食塩水、生理食塩水 + レーザー、RuDA、RuDA + レーザー、RuDA-NP、および RuDA-NP + レーザー グループを含む、さまざまな治療グループからの主要な臓器および腫瘍の E H&E 染色画像。 生理食塩水、生理食塩水 + レーザー、RuDA、RuDA + レーザー、RuDA-NP、および RuDA-NP + レーザー グループを含む、さまざまな治療グループからの主要な臓器および腫瘍の E H&E 染色画像。 Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. 生理食塩水、生理食塩水 + レーザー、RuDA、RuDA + レーザー、RuDA-NP、および RuDA-NP + レーザー グループを含む、さまざまな治療グループからの主要な臓器および腫瘍の E H&E 染色画像。異なる治療グループからの主要な器官および腫瘍の E H&E 染色画像には、塩水、塩水 + レーザー光、RuDA、RuDA + レーザー光、RuDA-NPs および RuDA-NPs + レーザー光セットが含まれます。さまざまな治療群の主要な器官および腫瘍に由来する E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. 生理食塩水、生理食塩水 + レーザー、RuDA、RuDA + レーザー、RuDA-NP、および RuDA-NP + レーザーを含むさまざまな治療グループからの主要臓器および腫瘍の E H&E 染色。スケール バー: 60 μ m。
RuDA および RuDA NP を用いた in vivo での光線療法の効果を評価しました。MDA-MB-231 腫瘍を有する裸のマウスに、尾静脈を介して 10.0 µmol kg-1 の単回用量で RuDA または RuDA NP を静脈内注射し、その後 8注射後数時間。波長808nmのレーザー照射。図 8B に示すように、生理食塩水群とレーザー群では腫瘍体積が有意に増加し、生理食塩水またはレーザー 808 照射が腫瘍の成長にほとんど影響を与えなかったことを示しています。生理食塩水群と同様に、レーザー照射の非存在下で RuDA-NP または RuDA で処理したマウスでも急速な腫瘍増殖が観察され、低暗毒性を示しました。対照的に、レーザー照射後、RuDA-NP と RuDA の両方の治療は、生理食塩水治療群と比較して、それぞれ 95.2% と 84.3% の腫瘍体積の減少を伴う有意な腫瘍退縮を誘発し、優れた相乗的 PDT を示しています。、RuDA / CHTV効果によって媒介されます。– NP または鉱石。RuDA と比較して、RuDA NP は、主に RuDA NP の EPR 効果による優れた光線療法効果を示しました。腫瘍成長阻害の結果は、治療の15日目に切除された腫瘍重量によってさらに評価されました（図8Cおよび補足図33）。ＲｕＤＡ－ＮＰ処置マウスおよびＲｕＤＡ処置マウスにおける平均腫瘍質量は、それぞれ０．０８および０．２７ｇであり、対照群（１．４３ｇ）よりもはるかに軽かった。
さらに、in vivo での RuDA-NP または RuDA の暗毒性を調べるために、マウスの体重を 3 日ごとに記録しました。図 8D に示すように、すべての治療群で体重の有意差は観察されませんでした。 さらに、さまざまな治療グループからの主要臓器 (心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓) のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色が行われました。 さらに、さまざまな治療グループからの主要な臓器 (心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓) のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色が行われました。 Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. さらに、さまざまな治療グループからの主要臓器 (心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓) のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色を実施しました。さらに、異なる治療群の主要器官（心臓、肝臓、脾臓、肺および肚）を木精および伊红（Ｈ＆Ｅ）染色した。 （彼） Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. さらに、主要な臓器 (心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓) のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色を、異なる治療群で実施しました。図に示すように、図８Ｅでは、ＲｕＤＡ－ＮＰおよびＲｕＤＡグループからの５つの主要臓器のＨ＆Ｅ染色画像は、明らかな異常または臓器損傷を示さない。 図８Ｅでは、ＲｕＤＡ－ＮＰおよびＲｕＤＡグループからの５つの主要臓器のＨ＆Ｅ染色画像は、明らかな異常または臓器損傷を示さない。図に示すように。8E では、H&E が RuDA-NPs と RuDA と RuDA の両方をサポートしています。 図８Ｅ、ＲｕＤＡ−ＮＰおよびＲｕＤＡ群からの５つの主要臓器のＨ＆Ｅ染色画像は、明らかな臓器異常または病変を示さない。図８Ｅに示すように、ＲｕＤＡ−ＮＰおよびＲｕＤＡ群の５つの主要な器官からのＨ＆Ｅ染色像は、明らかな異常または器官の転移を示さなかった。図８Ｅに示すように、ＲｕＤＡ－ＮＰおよびＲｕＤＡセットの５つの主要な器官からのＨ＆Ｅ 賛成派の≥8e8e、изображенияокрашиванияH＆eпяeもっと執行 図 8E に示すように、RuDA-NP および RuDA グループからの 5 つの主要臓器の H&E 染色画像は、明らかな異常や臓器損傷を示さなかった。これらの結果は、ＲｕＤＡ－ＮＰもＲｕＤＡもインビボで毒性の徴候を示さないことを示した。 さらに、腫瘍の H&E 染色画像は、RuDA + レーザーおよび RuDA-NP + レーザー グループの両方が重度の癌細胞破壊を引き起こす可能性があることを示し、RuDA および RuDA-NP の優れた in vivo 光線療法効果を示しています。 さらに、腫瘍の H&E 染色画像は、RuDA + レーザーおよび RuDA-NP + レーザー グループの両方が重度の癌細胞破壊を引き起こす可能性があることを示し、RuDA および RuDA-NP の優れた in vivo 光線療法効果を示しています。さらに、ヘマトキシリン-エオジン染色された腫瘍画像は、RuDA+レーザーおよびRuDA-NP+レーザー群の両方が癌細胞の重度の破壊を誘発できることを示し、in vivoでのRuDAおよびRuDA-NPの優れた光線療法効果を示しています。さらに、腫瘍のＨ＆Ｅ染色画像は、ＲｕＤＡ＋レーザーおよびＲｕＤＡ−ＮＰ＋レーザーの組み合わせがいずれも重度の癌細胞破壊を引き起こす可能性があることを示しており、ＲｕＤＡおよびＲｕＤＡ−ＮＰの優れた体内光機能が実証されている。さらに、腫瘍の & e 染色は、ruda + レーザーおよび ruda-nps + レーザー群全体が癌細胞の破壊を引き起こすことを示し、ruda および ruda-nps の体内光遮断を示しています。 。。。さらに、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された腫瘍画像は、RuDA+レーザーおよびRuDA-NP+レーザー群の両方が癌細胞の重度の破壊をもたらし、インビボでのRuDAおよびRuDA-NPの優れた光線療法効果を実証したことを示しました。
結論として、DA型リガンドを有するRu(II)-アレーン(RuDA)有機金属錯体は、凝集法を用いてISCプロセスを促進するように設計された。合成された RuDA は、非共有相互作用を介して自己組織化して RuDA 由来の超分子システムを形成し、それによって 1O2 形成と光誘発がん治療のための効率的な光熱変換を促進します。単量体の RuDA は 808 nm のレーザー照射下で 1O2 を生成しなかったが、凝集状態では大量の 1O2 を生成できたことは注目に値し、我々の設計の合理性と効率性を示しています。その後の研究では、超分子集合体が、PDT および PTT 処理に非常に望ましい、赤方偏移吸収や耐光退色性などの光物理的および光化学的特性の改善を RuDA に与えることが示されています。in vitro および in vivo 実験の両方で、良好な生体適合性と腫瘍への良好な蓄積を備えたRuDA NPが、808 nmの波長でのレーザー照射により優れた光誘発性抗がん活性を示すことが示されています。したがって、効果的なバイモーダル超分子 PDT/PTW 試薬としての RuDA NP は、800 nm を超える波長で活性化される光増感剤のセットを豊富にします。超分子システムの概念設計は、優れた光増感効果を持つ NIR 活性化光増感剤の効率的な経路を提供します。
すべての化学物質と溶媒は、市販の供給業者から入手し、さらに精製することなく使用しました。RuCl3 は、Boren Precious Metals Co., Ltd. (昆明、中国) から購入しました。[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-フェナントロリン-5,6-ジオン) および 4,7-ビス[4-(N,N-ジフェニルアミノ)フェニル]-5 ,6-ジアミノ-2,1,3-ベンゾチアジアゾールは、以前の研究に従って合成されました64,65。NMR スペクトルは、d6-DMSO または CDCl3 を溶媒として使用して、Southeastern University Analytical Test Center の Bruker Avance III-HD 600 MHz 分光計で記録しました。化学シフトδはppmで与えられる。テトラメチルシランに関して、相互作用定数 J はヘルツ単位の絶対値で与えられます。高分解能質量分析 (HRMS) は、Agilent 6224 ESI/TOF MS 機器で実行されました。C、H、および N の元素分析は、Vario MIROCHNOS 元素分析装置 (Elementar) で実行されました。紫外可視スペクトルは、Shimadzu UV3600 分光光度計で測定しました。蛍光スペクトルは、Shimadzu RF-6000分光蛍光計で記録されました。EPR スペクトルは、Bruker EMXmicro-6/1 機器で記録されました。準備されたサンプルの形態と構造は、200 kVの電圧で動作するFEI Tecnai G20（TEM）およびBruker Icon（AFM）機器で研究されました。Nanobrook Omni アナライザー (Brookhaven) で動的光散乱 (DLS) を実行しました。光電気化学特性は、電気化学セットアップ（CHI-660、中国）で測定されました。光音響画像は、FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR システムを使用して取得されました。共焦点画像は、Olympus FV3000 共焦点顕微鏡を使用して取得されました。BD CaliburフローサイトメーターでFACS分析を行った。高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 実験は、2489 UV/Vis 検出器を使用して、Waters Alliance e2695 システムで実行されました。ゲル透過クロマトグラフィー (GPC) テストは、ERC RefratoMax520 屈折率検出器を使用して、Thermo ULTIMATE 3000 機器で記録されました。
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-フェナントロリン-5,6-ジオン)64 (481.0 mg, 1.0 mmol), 4,7-ビス[4 -(N, N-ジフェニルアミノ)フェニル]-5,6-ジアミノ-2,1,3-ベンゾチアジアゾール65(652.0mg、1.0mmol)および氷酢酸(30mL)を還流冷蔵庫で12時間撹拌した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーターを使用して真空除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー (シリカゲル、CH2Cl2:MeOH = 20:1) で精製し、RuDA を緑色粉末として得た (収量: 877.5 mg、80%)。肛門。C64H48Cl2N8RuS の計算値: C 67.84、H 4.27、N 9.89。見つかった: C 67.92、H 4.26、N 9.82。1H NMR (600 MHz、d6-DMSO) δ 10.04 (s、2H)、8.98 (s、2H)、8.15 (s、2H)、7.79 (s、4H)、7.44 (s、8H)、7.21 (d、 J = 31.2 Hz、16H)、6.47 (秒、2H)、6.24 (秒、2H)、2.69 (秒、1H)、2.25 (秒、3H)、0.99 (秒、6H)。13C NMR（150 MHz、D6-DMSO）、Δ（ppm）158.03、152.81、149.31、147.98、147.16、139.98、136.21、135.57、134.68、130.34、130.02、128.68、128.01、125.51、125.51、125.51、125.51、125.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5.51 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097.25。
4,7-ビス[4-(N,N-ジエチルアミノ)フェニル-5,6-ジアミノ-2,1,3-ベンゾチアジアゾール(L2)の合成:L2は2段階で合成した。Pd(PPh3)4 (46 mg, 0.040 mmol) を N,N-ジエチル-4-(トリブチルスタンニル)アニリン (1.05 g, 2.4 mmol) と 4,7-ジブロモ-5,6-ジニトロ溶液 - 2,乾燥トルエン（100ml）中の1,3-ベンゾチアジアゾール（0.38g、1.0mmol）。混合物を１００℃で２４時間撹拌した。トルエンを真空で除去した後、得られた固体を石油エーテルで洗浄した。次に、この化合物 (234.0 mg, 0.45 mmol) と鉄粉 (0.30 g, 5.4 mmol) の酢酸 (20 ml) 混合物を 80 ℃ で 4 時間攪拌した。反応混合物を水中に注ぎ、得られた茶色の固体を濾過により集めた。生成物を真空昇華によって２回精製して、緑色の固体（１２６．２ｍｇ、収率５７％）を得た。肛門。C26H32N6S について計算: C 67.79、H 7.00、N 18.24。見つかった: C 67.84、H 6.95、H 18.16。1H NMR (600 MHz、CDCl3)、δ (ppm) 7.42 (d、4H)、6.84 (d、4H)、4.09 (s、4H)、3.42 (d、8H)、1.22 (s、12H)。13С NMR (150 MHz、CDCl3)、δ (ppm) 151.77、147.39、138.07、131.20、121.09、113.84、111.90、44.34、12.77。ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461.24。
ＲｕＤＡと同様の手順に従って、化合物を調製および精製した。肛門。C48H48Cl2N8RuS について計算: C 61.27、H 5.14、N 11.91。測定値: C、61.32、H、5.12、N、11.81、1H NMR (600 MHz、d6-DMSO)、δ (ppm) 10.19 (s、2H)、9.28 (s、2H)、8.09 (s、2H)、 7.95 (s, 4H), 6.93 (s, 4H), 6.48 (d, 2H), 6.34 (s, 2H), 3.54 (t, 8H), 2.80 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.31 (t、12H)、1.07 (s、6H)。13C NMR（151 MHz、CDCL3）、Δ（PPM）158.20、153.36、148.82、148.14、138.59、136.79、135.75、134.71、130.44、128.87、128.35、121.70、111.84、110.76、110.76、110.76、110.076。、38.06、31.22、29.69、22.29、19.19、14.98、12.93。ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905.24。
ＲｕＤＡをＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５／９５、ｖ／ｖ）に１０μＭの濃度で溶解した。RuDA の吸収スペクトルは、波長 808 nm (0.5 W/cm2) のレーザー光を照射した状態で、Shimadzu UV-3600 分光光度計で 5 分ごとに測定されました。ICG スペクトルは、標準と同じ条件下で記録されました。
EPR スペクトルは、20 mW のマイクロ波出力、100 G の走査範囲、および 1 G の電界変調を備えた Bruker EMXmicro-6/1 分光計で記録されました。 (TEMP) および 5,5-ジメチル-1-ピロリン N-オキシド (DMPO) をスピン トラップとして使用しました。電子スピン共鳴スペクトルは、RuDA (50 µM) と TEMF (20 mM) または DMPO (20 mM) の混合溶液について、波長 808 nm (0.5 W/cm2) のレーザー放射の作用下で記録されました。
RuDAのDFTおよびTD-DFT計算は、ガウスプログラム1666,67,68を使用して、水溶液中のPBE1PBE / 6–31 G * //LanL2DZレベルで実行されました。GaussView プログラム (バージョン 5.0) を使用して、低エネルギー一重項励起状態 RuDA の HOMO-LUMO、正孔、電子の分布をプロットしました。
最初に、ICG (ΦΔ = 0.002) を標準として従来の紫外可視分光法を使用して 1O2 RuDA の生成効率を測定しようとしましたが、ICG の光分解が結果に大きく影響しました。そこで、1O2 RuDA の量子収率は、波長 808 nm (0.5 W/cm2) のレーザーを照射したときの約 428 nm での ABDA 蛍光強度の変化を検出することによって測定しました。ABDA（50μM）を含む水/ DMF（98/2、v / v）中のRuDAおよびRuDA NP（20μM）で実験を行いました。1O2 の量子収率は、次の式を使用して計算されました: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG)。rPS と rICG は、それぞれ光増感剤と ICG から得られた 1O2 と ABDA の反応速度です。APS と AICG は、それぞれ 808 nm での光増感剤と ICG の吸光度です。
Ｂｒｕｋｅｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ ＡＦＭシステムのスキャンモードを使用して、液体状態でＡＦＭ測定を行った。液体細胞の開いた構造を使用して、細胞をエタノールで2回洗浄し、窒素流で乾燥させました。乾燥した細胞を顕微鏡の光学ヘッドに挿入します。すぐにサンプルを一滴液体のプールに入れ、滅菌使い捨てプラスチック注射器と滅菌針を使用してカンチレバーに置きます。もう 1 滴をサンプル上に直接置き、光学ヘッドを下げると 2 つの滴が融合し、サンプルと液体リザーバの間にメニスカスが形成されます。AFM 測定は、SCANASYST-FLUID V 型窒化物カンチレバー (Bruker、硬度 k = 0.7 N m-1、f0 = 120 ～ 180 kHz) を使用して実行されました。
HPLC クロマトグラムは、2489 UV/Vis 検出器を使用して、phoenix C18 カラム (250 x 4.6 mm、5 μm) を備えた Waters e2695 システムで取得しました。検出器の波長は 650 nm です。移動相 A と B はそれぞれ水とメタノールで、移動相の流量は 1.0 ml·min-1 でした。勾配 (溶媒 B) は次のとおりでした: 0 ～ 4 分で 100%、5 ～ 30 分で 100% から 50%、31 ～ 40 分で 100% にリセット。鉱石を、メタノールと水の混合溶液（体積比で 50/50）に 50 μM の濃度で溶解しました。注入量は20μlであった。
ＧＰＣアッセイは、２本のＰＬアクアゲル－ＯＨ ＭＩＸＥＤ－Ｈカラム（２×３００×７．５ｍｍ、８μｍ）およびＥＲＣ ＲｅｆｒａｔｏＭａｘ５２０屈折率検出器を備えたＴｈｅｒｍｏ ＵＬＴＩＭＡＴＥ ３０００装置で記録した。ＧＰＣカラムは、流速１ｍｌ／分、３０℃の水で溶出した。鉱石 NP は PBS 溶液 (pH = 7.4、50 μM) に溶解し、注入量は 20 μL でした。
光電流は、電気化学セットアップ（CHI-660B、中国）で測定されました。レーザーをオンおよびオフにしたときの光電子応答 (808 nm、0.5 W/cm2) を、ブラック ボックス内で電圧 0.5 V でそれぞれ測定しました。標準的な 3 電極セルは、作用電極として L 字型グラッシー カーボン電極 (GCE)、参照電極として標準カロメル電極 (SCE)、対極として白金ディスクを使用して使用されました。0.1 M Na2SO4 溶液を電解液として使用しました。
ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-231 は、KeyGEN Biotec Co., LTD (南京、中国、カタログ番号: KG033) から購入しました。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の溶液を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、高グルコース）中で単層で増殖させた。すべての細胞は、5% CO2 を含む湿気のある環境で 37°C で培養されました。
MTT アッセイを使用して、Vc (0.5 mM) の有無にかかわらず、光照射の存在下および非存在下での RuDA および RuDA-NP の細胞毒性を測定しました。MDA-MB-231 癌細胞を 96 ウェル プレートで約 1 x 105 細胞/ml/ウェルの細胞密度で増殖させ、5% CO2 および 95% 空気の雰囲気中、37.0°C で 12 時間インキュベートしました。水に溶解したＲｕＤＡおよびＲｕＤＡ ＮＰを細胞に添加した。１２時間のインキュベーション後、細胞を波長８０８ｎｍの０．５Ｗｃｍ －２ レーザー放射に１０分間曝露し（３００Ｊｃｍ －２ ）、次に暗所で２４時間インキュベートした。次いで、細胞をMTT(5mg/ml)と共にさらに5時間インキュベートした。最後に、培地を DMSO (200 μl) に変更して、得られた紫色のホルマザン結晶を溶解します。OD 値は、波長 570/630 nm のマイクロプレートリーダーを使用して測定しました。各サンプルの IC50 値は、少なくとも 3 回の独立した実験から得られた用量反応曲線から SPSS ソフトウェアを使用して計算されました。
MDA-MB-231細胞を50μMの濃度のRuDAおよびRuDA-NPで処理しました。１２時間のインキュベーション後、細胞に波長８０８ｎｍ、出力０．５Ｗ／ｃｍ ２ のレーザーを１０分間照射した（３００Ｊ／ｃｍ ２ ）。ビタミン C (Vc) グループでは、レーザー照射前に細胞を 0.5 mM Vc で処理しました。次に、細胞を暗所でさらに24時間インキュベートし、カルセインAMおよびヨウ化プロピジウム（20μg/ ml、5μl）で30分間染色し、PBS（10μl、pH 7.4）で洗浄しました。染色された細胞の画像。
投稿時間: Sep-23-2022
