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がん細胞は、細胞ストレスを克服し、進行し続けるために、さまざまなメカニズムを進化させてきました。プロテイン キナーゼ R (PKR) とそのタンパク質活性化因子 (PACT) は、細胞増殖とアポトーシスの阻害につながるさまざまなストレス シグナルを監視する初期レスポンダーです。ただし、がん細胞における PACT-PKR 経路の調節はほとんど不明のままです。ここでは、長い非コード RNA (lncRNA) アスパルチル tRNA 合成酵素アンチセンス RNA 1 (DARS-AS1) が PACT-PKR 経路の阻害に直接関与し、がん細胞の増殖を促進することを発見しました。CRISPRi 971 がん関連 lncRNA の大規模な機能スクリーニングを使用して、DARS-AS1 ががん細胞増殖の有意な増強と関連していることを発見しました。したがって、DARS-AS1 ノックアウトは、in vitro でさまざまながん細胞株の細胞増殖を阻害し、がん細胞のアポトーシスを促進し、in vivo での腫瘍増殖を大幅に減少させます。機械的に、DARS-AS1 は PACT 活性化ドメインに直接結合し、PACT-PKR 相互作用を防ぎ、それによって PKR 活性化、eIF2α リン酸化を減少させ、アポトーシス細胞死を阻害します。臨床的には、DARS-AS1 は複数の癌で広く発現しており、この lncRNA の過剰発現は予後不良を示しています。この研究は、DARS-AS1 lncRNA による PACT-PKR 経路の癌特異的調節を解明し、癌の予後と治療のための別の標的を提供します。
ストレスに適応する能力は、がん細胞の生存と増殖の重要な特徴です。癌の急速な増殖と代謝の特徴は、細胞死シグナル伝達経路を引き起こす可能性のある過酷な微小環境 (栄養欠乏、低酸素、および低 pH) でピークに達します。p535、熱ショックタンパク質 6、7、KRAS8、9、および HIF-110、11、12、13 などのストレス感受性遺伝子の調節不全は、癌で頻繁に観察され、それによってアポトーシスをブロックし、生存を促進します。
プロテインキナーゼ R (PKR) は重要なストレス センサーであり、真核生物開始因子 2α (eIF2α) のサブユニット キナーゼであり、細胞ストレスを細胞死に結びつける翻訳調節因子です。PKR はもともと、外来の二本鎖 RNA (dsRNA) の検出によって抗ウイルスタンパク質として同定されました。活性化されると、PKR は eIF2α をリン酸化し、ウイルスおよび細胞のタンパク質合成を阻害します 14,15,16。PACT (PKR 活性化タンパク質) は、dsRNA の非存在下で最初の PKR 活性化タンパク質として同定されました17,18,19,20,21,22,23。PACT は、PKR との直接的な相互作用を通じて、さまざまなストレス (血清飢餓、過酸化物または亜ヒ酸処理) を PKR および下流のシグナル伝達経路に伝達します。eIF2α リン酸化に加えて、PACT を介した PKR 活性化は、PI3K/Akt24 経路を介した酸化還元状態の変化、p5325,26 および NF-κB27,28 を介した DNA 損傷チェックの強化など、ストレス応答に関連するさまざまなイベントを引き起こします。ストレス応答、増殖、アポトーシス、およびその他の重要な細胞プロセスにおける重要な役割を考えると、PKR と PACT は、多くの疾患、特に癌の治療標的として有望です30,31,32,33。ただし、この多面的な機能的および生物学的重要性にもかかわらず、癌細胞における PACT/PKR 活性の調節はとらえどころのないままです。
lncRNA は、200 ヌクレオチドを超える転写産物であり、タンパク質をコードする可能性はありません。最先端の全ゲノム配列決定プロジェクトによって何千もの lncRNA が同定されて以来 35,36、それらの生物学的機能を解明するために多大な努力が払われてきました。ますます多くの研究が、lncRNA が X 染色体の不活性化 38,39、刷り込み 40、転写 41,42、翻訳 43、さらには癌の成長 44,45,46,47 の調節を含む多くの生物学的プロセスに関与していることを示しています。これらの研究は、多くの lncRNAs が PACT/PKR 経路に関与していることを報告しました。そのような研究の1つは、lncRNA ASPACTがPACT転写を阻害し、PACT mRNAの核保持を増加させることを示しました。他の研究では、lncRNA nc886 が PKR に結合し、そのリン酸化を阻害することが示されています 49,50。これまでのところ、PACT を介した PKR 活性化を調節する lncRNA は報告されていません。
アスパルチル tRNA 合成酵素アンチセンス RNA 1 (DARS-AS1) は、発癌性 lncRNA として同定されています 51,52,53,54。miP-194-5p53、miP-12952、および miP-532-3p51 の調節を通じて、DARS-AS1 は、明細胞腎細胞癌、甲状腺癌、および非小細胞肺癌の増殖をそれぞれ促進することが示されています。Tong らはまた、DARS-AS1 がタンパク質 39 (RBM39) RNA 結合モチーフの安定性を維持することによって骨髄腫の進行を促進することも発見しました。ただし、この lncRNA が PACT-PKR 活性化の調節やがん細胞のストレス応答に関与しているかどうかについては、研究が行われていません。
ここでは、CRISPRi システムを使用して大規模な機能喪失スクリーニングを実行し、DARS-AS1 lncRNA が数種類のがん細胞の増殖を促進することを確認しました。さらに、主要なメカニズムを特定しました。DARS-AS1 は PACT に直接結合し、PACT と PKR の結合を阻害し、PKR の下位基質である eIF2α のリン酸化を防ぎ、最終的にアポトーシス細胞死を阻害します。結論として、私たちの研究は、DARS-AS1 lncRNAがPACT-PKR経路の調節因子であり、癌の治療と予後の潜在的な標的であることを明らかにしています。
広範なゲノムプロファイリング研究により、がんに関連する数百の lncRNA が特定されています。しかし、それらの機能はほとんど不明のままです56。がんの進行に関与する有望なlncRNA候補を特定するために、CRISPRiシステムを使用して、SW620結腸直腸がん細胞株の増殖の減少について機能喪失スクリーニングを実行しました（図1a）。SW480 および SW620 結腸癌細胞株のユニークな特徴は、それらが 1 人の患者の原発性および二次性腫瘍に由来することです。これは、進行性結腸癌の進行における遺伝的変化を研究するための貴重な比較を提供します。したがって、RNAシーケンスを使用して結腸直腸癌細胞株（SW480およびSW620）のトランスクリプトームを分析し、公開された文献からいくつかの潜在的な機能的lncRNAを収集しました。これらの結果に基づいて、971 個の癌関連 lncRNA をターゲットとする 7355 個の sgRNA オリゴと、ネガティブ コントロール用の 500 個の非ターゲット sgRNA オリゴを含むプールされた sgRNA ライブラリを設計しました (補足データ 1)。
CRISPRi システムを使用したスクリーニングの概略図。bスクリーニング後のsgRNA濃縮。横の点線は、log2 (倍率変化) = ±0.58 を表します。縦の点線は p 値 = 0.05 を示します。黒い点は、非ターゲット sgRNA (NC として指定) を表します。赤い点は、DARS-AS1 をターゲットとする sgRNA です。青い点は、前述の発癌性 lncRNA である LINC00205 をターゲットとする sgRNA です。倍率変化 = (正規化された読み取り値、17 日目)/(正規化された読み取り値、0 日目)。c DARS-AS1 sgRNAノックダウンは細胞増殖を阻害しました。エラーバーは、3 つの実験の ± 標準偏差を表します。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01 両側スチューデントの t 検定。d腫瘍におけるDARS-AS1発現（TCGAデータセット）。em BLCA、KIRC、PRAD、LUSC、UCEC、LUAD、LIHC、KIRP、およびCOADをそれぞれ有する患者からの正常および腫瘍サンプルの対におけるDARS-AS1の発現(TCGAデータセット)。p値は、対応のある両側スチューデントのt検定を使用して取得されました。
プラスミドを構築し、レンチウイルスをパッケージングした後、4つの独立した感染実験で、dCas9-SW620結腸直腸癌細胞株に上記のライブラリを形質導入しました。これらの感染の多重度 (MOI) は 0.1 ～ 0.3 であり、各細胞に 1 つの sgRNA しかトランスフェクトでき​​ないことを示しています。18 日間の in vitro 培養後、ターゲット sgRNA の濃縮プロファイルはスクリーニング後に減少または増加しましたが、非ターゲット コントロール オリゴヌクレオチドの数はスクリーニング前のプロファイルと比較して比較的変化していませんでした。図書館。米。1b および補足表 1)。 肺がんおよび肝臓がんの進行を促進することが以前に報告された LINC00205 がスクリーニングされ (log2 (foldchange) < -0.58、p 値 < 0.05)、このスクリーニングの信頼性が確認されました (図 1b)。 肺がんおよび肝臓がんの進行を促進することが以前に報告された LINC00205 がスクリーニングされ (log2 (foldchange) < -0.58、p 値 < 0.05)、このスクリーニングの信頼性が確認されました (図 1b)。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b)。 以前に肺がんと肝臓がんの進行を促進すると報告された LINC00205 は除外され (log2 (変化倍率) <-0.58、p 値 <0.05)、このスクリーニングの堅牢性が確認されました (図 .1b)。 . LINC00205 はこれまでに肺癌および肝癌の進行を促進する可能性があることが確認されており 58,59,60、選択されている（log2（倍数変化）< -0.58、p 値 < 0.05）ことから、この選択の可能性が証明されています（図 1b）。 LINC00205 はこれまでに肺癌および肝癌の進行を促進する可能性があることが確認されており 58,59,60、選択されている（log2（倍数変化）< -0.58、p 値 < 0.05）ことから、この選択の可能性が証明されています（図 1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b)。 以前に肺がんおよび肝臓がんの進行を促進すると報告された LINC00205 は除外され (log2 (倍数変化) <-0.58、p 値 <0.05)、このスクリーニングの堅牢性が確認されました (図 .1b)。
テストしたすべてのlncRNAの中で、DARS-AS1もスクリーニングされ、3つの同族sgRNAオリゴヌクレオチドが培養18日後に大幅に減少し、このlncRNAのノックダウンが癌増殖の減少をもたらすことが示唆されました（図1b）。この結果は、DARS-AS1 ノックダウン細胞の増殖率が対照細胞と比較して半分にすぎないことを示す結腸直腸癌細胞の MTS 分析によってさらに裏付けられ (図 1c)、他のいくつかの癌タイプの以前の報告と一致していました。: 明細胞腎がん、甲状腺がん、非小細胞肺がん51,52,53,55。ただし、結腸直腸癌におけるその機能と分子メカニズムは未調査のままです。したがって、さらなる研究のためにこのlncRNAを選択しました。
患者の DARS-AS1 発現を研究するために、Cancer Genome Atlas (TCGA) プロジェクトからの 10,327 の腫瘍サンプルを包括的に分析しました。私たちの結果は、DARS-AS1が結腸腺癌（COAD）、腎明細胞癌（KIRC）、腎乳頭細胞癌（KIRP）など、さまざまな腫瘍の健康な細胞で広く発現し、大幅にアップレギュレートされていることを示しています。.非常に少ない（図1dおよび補足図1a、b）。 対になった健康/腫瘍サンプルの分析により、膀胱尿路上皮がん (BLCA)、腎腎明細胞がん (KIRC)、前立腺腺がん (PRAD)、肺扁平上皮がん (LUSC) の腫瘍における DARS-AS1 の有意に高い発現がさらに確認されました。 、子宮体部子宮内膜癌（UCEC）、肺腺癌（LUAD）、肝肝細胞癌（LIHC）、腎腎乳頭細胞癌（KIRP）、および結腸腺癌（COAD）（p値<0.05）（図1e–m） . 対になった健康/腫瘍サンプルの分析により、膀胱尿路上皮がん (BLCA)、腎腎明細胞がん (KIRC)、前立腺腺がん (PRAD)、肺扁平上皮がん (LUSC) の腫瘍における DARS-AS1 の有意に高い発現がさらに確認されました。 、子宮体部子宮内膜癌（UCEC）、肺腺癌（LUAD）、肝肝細胞癌（LIHC）、腎腎乳頭細胞癌（KIRP）、および結腸腺癌（COAD）（p値<0.05）（図1e–m） .ペアの健康/腫瘍サンプルの分析では、膀胱尿路上皮がん (BLCA)、明細胞腎および腎細胞がん (KIRC)、前立腺腺がん (PRAD)、肺扁平上皮がん (LUSC) 腫瘍における DARS-AS1 の有意に高い発現も確認されました。, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . 、子宮体部の子宮内膜がん（UCEC）、肺の腺がん（LUAD）、肝臓の肝細胞がん（LIHC）、腎臓の乳頭細胞がん（KIRP）、および結腸の腺がん（COAD）（p値< 0.05) (図 1e-m) .健康/腫瘍本に関する分析により、DARS-AS1が膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明細胞癌(KIRC)、前列腺癌(PRAD)、肺胞状細胞癌(LUSC)の腫瘍に存在することがさらに証明されました。より高次の発現を伴う、子宫体子宫内膜癌（UCEC）、肺腺癌（LUAD）、肝肝細胞癌（LIHC）、肾肾乳头状細胞癌（KIRP）および結腸肠腺癌（COAD）（p值） <0.05）（図1e-m） .栄養/腫瘍本 の分析により、dars-os1 が尿路上皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细細胞癌 细細胞癌 细細胞癌 细細胞癌 前列 腺癌 腺癌 (prad) 、 细細胞癌 细細胞癌 であることが証明されました。 (lusc) 肿腫瘍 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 より高い 表达 、 内膜癌 ((ucel) 肺腺癌 (luad) 肝肝細胞癌 (lihc) 肾肾乳头状细細胞癌 （kirp） （coad） （p 値 <0.05）（図 1e-m） .健康/腫瘍ペアのサンプルの分析は、膀胱尿路上皮がん (BLCA)、明細胞腎細胞がん (KIRC)、前立腺腺がん (PRAD)、および肺扁平上皮がん (LUSC) 腫瘍における DARS-AS1 の役割をさらに裏付けました。экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m)。 子宮体癌 (UCEC)、肺腺癌 (LUAD)、肝細胞癌 (LIHC)、腎乳頭細胞癌 (KIRP)、および結腸腺癌 (COAD) における発現 (p 値 <0.05) (図 1e -m)。まとめると、これらの結果は、DARS-AS1 がさまざまな癌で広く高度に発現していることを示しています。
DARS-AS1 と DARS (アンチセンス鎖をコードする遺伝子) は同じプロモーターを共有し、隣り合って配置されているため、DARS ではなく DARS-AS1 を特異的にノックダウンするように shRNA を設計しました (補足図 2a、b および補足表 2)。 .SW620に加えて、DARS-AS1を高度に発現する他の3つの細胞株も使用して、shRNAノックダウンの有効性と機能を研究しました（補足表3）。私たちの結果は、開発された3つのshRNAすべてが、DARS mRNAの量にほとんど影響を与えずに、少なくとも80％のDARS-AS1ノックダウン効率を達成したことを示しました（補足図2c–f）。さらに、これらの shRNA による DARS-AS1 ノックダウンは、結腸直腸癌細胞株 SW620 (49.7%) および HCT116 (27.7%)、乳癌細胞株 MBA-MD-231 (53.4%) の細胞増殖を有意に阻害することがわかりました。）およびHepG2ヘパトーマ細胞株（92.7％の減少）、および固定されていない球体を形成する能力（細胞株あたり平均約50.8％、44.6％、40.7％、および75.7％の減少）（図2a、b）。SW620では、コロニー形成アッセイの結果により、DARS-AS1 shRNAが細胞増殖を有意に阻害し、平均で約69.6％減少することがさらに確認されました（図2c）。
SW620、HCT116、MBA-MD-231、および HepG2 細胞における細胞増殖 (a) およびスフェロイド形成 (b) に対するコントロール shRNA および DARS-AS1 shRNA の効果。c SW620細胞におけるコロニー形成に対する対照shRNAおよびDARS-AS1 shRNAの効果。DARS-AS1 を過剰発現する SW620 細胞の細胞増殖 (d)、スフェロイド形成 (e)、およびコロニー形成 (f)。示されているデータは、3 つの実験の平均 ± 標準偏差です。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、および *** p ≤ 0.001 (両側スチューデントの t 検定による)。
機能喪失研究を補完するために、次にDARS-AS1を過剰発現するSW620細胞を作成しました（補足図2g）。DARS-AS1の過剰発現は、SW620細胞の細胞増殖（1.8倍）、固定されていないスフェロイド形成（1.4倍）、およびコロニー形成（3.3倍）を大幅に増加させました（図2d–f）。別のDARS-AS1発現細胞株A549を使用して、この結果を確認しました。DARS-AS1の過剰発現によるこの細胞増殖の増強は、A549細胞でさらに観察されました（補足図2h、iおよび補足表3）。まとめると、これらの利得と損失の研究は、DARS-AS1 が in vitro で癌細胞の増殖を促進することを示しています。
DARS-AS1 が細胞増殖を調節する根本的なメカニズムを調査するために、RNA プルダウン分析を実行して、その潜在的なタンパク質結合パートナーを特定しました。RT-qPCRの結果は、DARS-AS1の約86.2％がSW620細胞の細胞質にあることを示しました（補足図3a）。次に、インビトロで転写されたビオチン化DARS-AS1または偽RNAをSW620細胞溶解物とインキュベートした後、SDS-PAGE分離を行いました。その後の銀染色は、DARS-AS1プルサンプルでは明確なバンド（〜38 kDa）が大幅に濃縮されているが、ダミーRNAまたはビーズサンプルでは濃縮されていないことを示しました（図3a）。このバンドは、質量分析法（MS）によってPKR活性化タンパク質（PACT）として同定され、SW620、HCT116、およびHepG2細胞株での免疫ブロット法によってさらに確認されました（図3a、b）。DARS および関連する PACT タンパク質 (PKR および TRBP) の濃縮も、ウェスタンブロッティング (WB) による RNA 分析を使用して調査しました。結果は、DARS-AS1 RNAとこれら3つのタンパク質との間に直接的な相互作用が見つからなかったことを示しました（補足図3b）。DARS-AS1 と PACT の間の特異的な相互作用は、RNA 免疫沈降 (RIP) 分析によってさらに確認され、DARS-AS1 は抗 PACT 抗体で有意に濃縮されているが、他のコントロール RNA では濃縮されていないことが示されました (図 3c)。DARS-AS1 が他の細胞成分の非存在下で PACT と直接相互作用するかどうかを判断するために、精製された PACT を使用して in vitro バイオレイヤー干渉法 (BLI) アッセイを実施しました。ビオチン標識DARS-AS1またはダミーRNAをストレプトアビジン（SA）バイオセンサーに固定し、1μMPACTを含む動的バッファーでインキュベートしました。特に、PACTはDARS-AS1に強く結合しましたが（KD値〜26.9 nM）、RNAを模倣することはありませんでした（図3d）。まとめると、これらの結果は、DARS-AS1 と PACT の間の直接的な相互作用と高い親和性を示しています。
RNA プル分析により、SW620 細胞で PACT と相互作用する DARS-AS1 が特定されました。上、関連タンパク質の銀染色。抗PACT抗体を用いて下部免疫ブロットを行った。b RNAプルダウン分析は、HCT116（上）およびHepG2（下）細胞で実行されました。PACT の濃縮は、イムノブロッティングによって検出されました。示された抗体を使用して、SW620細胞でcRNA免疫沈降（RIP）アッセイを実施しました。d全長DARS-AS1または対照RNAへのPACT結合曲線は、バイオレイヤー干渉法（BLI）を使用して取得されました。RNA は、ストレプトアビジン バイオ センサーに固定化されました。会合を測定するために１μＭＰＡＣＴを使用した。RNAプルアッセイは、ビオチン化された全長DARS-AS1または切断されたもの（上）を使用して実行されました。受信した PACT を示す免疫ブロット (下)。f精製されたフラグ付きPACTを、ビオチン化された全長DARS-AS1とインキュベートするか、 in vitro RIPアッセイ用に切り詰めました（ eのように）。抽出された RNA は、RT-qPCR によって検証されました。g PACTに対するさまざまなRNAフラグメントの相対的な親和性は、バイオレイヤー干渉法を使用して取得されました。分析には、100 nM RNA と 1 μM RAST を使用しました。h インビトロRIPアッセイは、精製された無傷または切断された標識PACTを使用して実行されました。抽出された RNA は、RT-qPCR によって検証されました。i DARS-AS1、PACT、またはその両方を過剰発現する SW620 細胞の増殖率。j SW620 細胞における全長または切断型 DARS-AS1 の過剰発現は、細胞増殖にさまざまな影響を及ぼしました。kアポトーシスは、抗PARP抗体を用いたイムノブロッティングによって検出されました。l フローサイトメトリーで示されるように、DARS-AS1 のノックアウトは SW620 細胞のアポトーシスを誘導します。示されているデータは、3 つの実験の平均 ± 標準偏差です。 *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p < 0.0001、スチューデントの両側 t 検定による。 *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p < 0.0001、スチューデントの両側 t 検定による。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p < 0.0001 (両側スチューデントの t 検定による)。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 双尾学生による検査。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 双尾学生による検査。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p < 0.0001 (両側スチューデントの t 検定による)。
次に、in vitro 転写によって 3 つのビオチン化 DARS-AS1 RNA フラグメントを生成し、PACT 結合に必要な DARS-AS1 領域を特定しました（図 3e）。RNA分析の結果は、各フラグメントがPACTと相互作用できることを示しましたが、3 '末端領域（A3とラベル付けされた384〜768ヌクレオチド）は、A1とラベル付けされた1〜384個を超えるヌクレオチドを示しました）（図3e）。組換え PACT を使用した in vitro RIP アッセイでも同様の結果が観察されました (図 3f)。これらの結果と一致して、固定化された RNA フラグメントを BLI を使用して PACT に結合する実験では、PACT が A3 (384 ～ 768 nt) に対してより高い親和性を持ち (約 94.6 nM の KD 値)、他の領域とのリンクはほとんどないことも示されました。（図3d）。
また、PACT で関連する結合領域も調べました。PACT には 3 つの機能ドメインが含まれており、そのうちの 2 つは保存された二本鎖 RNA 結合ドメイン (dsRBD) であり、3 つ目のドメイン (D3 と呼ばれる) はタンパク質相互作用の活性化因子として機能します。各ドメインの lncRNA 結合能力を調べるために、3 つのドメインのそれぞれを削除する 3 つの変異を設計し、in vitro RIP アッセイを実行しました。私たちの結果は、PACTの3番目のドメイン（D3）の削除により、他の2つの変異と比較してDARS-AS1との相互作用が大幅に減少したことを示しました（無傷のPACTと比較して0.11倍）（図3h）。の D3 が DARS とやり取りしました。-AC1.まとめると、これらの結果は、DARS-AS1 と PACT の間の相互作用が、主に DARS-AS1 の 3 ' 末端と PACT の D3 ドメインを介して発生する可能性があることを示唆しています。
DARS-AS1 は PACT 発現に影響を与えず、PACT は DARS-AS1 に影響を与えないことに注目しました (補足図 3c)。次に、細胞増殖に対する PACT ノックダウンの効果を調べました。DARS-AS1とは対照的に、PACTがノックダウンされた場合、相対的な細胞は1.5〜3倍速く成長しました（補足図3d）。コロニー形成アッセイの結果は、PACTによるshRNA処理後に細胞が2〜3倍のコロニーを形成したことを示しました（補足図3e）。DARS-AS1 が PACT を介して細胞増殖を調節するかどうかをテストするために、PACT、DARS-AS1、またはその両方を過剰発現する SW620 細胞を生成しました。PACT の過剰発現は、細胞増殖の有意な阻害を示しました (図 3i)。DARS-AS1 の過剰発現自体は細胞増殖を有意に促進しましたが、DARS-AS1 と PACT を過剰発現した細胞の増殖速度に有意差はありませんでした。これらの結果は、PACT が DARS-AS1 の過剰発現によって引き起こされる増殖の増加に対抗する可能性があることを示唆しています。
DARS-AS1 の異なる領域は異なる PACT 結合能力を持っているため、DARS-AS1 フラグメントの異なる過剰発現による細胞増殖に対するそれらの相対的な影響を調査しました。他の2つのフラグメントと比較して、DARS-AS1は、DARS-AS1の主要なPACT関連領域である3 '末端（384〜768 ​​nt）で過剰発現しており、細胞増殖を刺激する能力が最も高かった（図3j）。これらの結果は、DARS-AS1 の結合能力と生物学的機能との間に正の相関関係があることを示しています。
PACT はプロアポトーシスタンパク質であることが報告されています19。したがって、アポトーシスに対するDARS-AS1の効果を調査しました。予想通り、DARS-AS1 ノックダウンは SW620 細胞で PARP 切断を有意に増加させ、SW620、HCT116、HepG2、および MBA-MD-231 細胞株でアネキシン V 陽性細胞の割合を増加させました (図 3k)。3)。3f–h) は、がん細胞における DARS-AS1 の抗アポトーシス効果が、PACT のアポトーシス誘導機能と反対であることを示しています。まとめると、これらの結果は、DARS-AS1 発癌機能の機序が PACT 機能の阻害による可能性があることを示唆しています。
次に、DARS-AS1-PACT アソシエーションの機能的な意味を調べました。PACT は、直接的な相互作用を介して PKR を活性化し、その後 eIF2α リン酸化を促進し、翻訳欠失とアポトーシスを引き起こすことが報告されています 17。まず、DARS-AS1 が PACT と PKR の細胞内局在に影響を与えるかどうかを調べました。共焦点蛍光顕微鏡は、PACT と PKR が SW620 細胞に高度に共局在し、平均ピアソン相関係数が 0.72 であることを示しました。一方、DARS-AS1の過剰発現は、PACTとPKRの共局在を大幅に減少させました（平均ピアソン相関係数0.61）（図4a）。DARS-AS1がPACT-PKR相互作用を調節できるかどうかを調べるために、SW620細胞溶解物で抗PACT抗体を使用して共免疫沈降（co-IP）アッセイを実行しました。PKRはコントロール細胞の抗PACTで非常に濃縮されていましたが、DARS-AS1を過剰発現している細胞からの溶解物ではPKRの回復が大幅に減少しました（図4b）。精製標識 PACT および PKR を in vitro タンパク質結合アッセイに使用しました。したがって、DARS-AS1を提供したがコントロールRNAを提供しなかったものは、PACT-PKR相互作用の抑制を示しました（図4c）。すべての結果は、DARS-AS1 が PACT と PKR の通信を妨害したことを示しています。
対照細胞またはDARS-AS1を過剰発現する細胞におけるPACTとPKRの共局在化は、共焦点蛍光顕微鏡を使用して観察されました。核はDAPIで染色されました。統計結果は 16 枚の写真から得られました。bコントロールSW620細胞またはDARS-AS1を過剰発現する細胞の細胞溶解物における抗PACT抗体を使用した共免疫沈降（co-IP）。c標識されたPACT、精製されたPKR、およびDARS-AS1またはモックRNAを用いてin vitroで転写されたものを、in vitroタンパク質結合分析のためにインキュベートした。抗フラグ抗体を免疫沈降に使用しました。d表示された抗体を用いた免疫ブロットは、コントロールshRNAまたはDARS-AS1-shRNAをトランスフェクトしたSW620およびHCT116細胞で実施され、続いて血清飢餓が行われました。e DARS-AS1 発現レベルは、タプシガルギンに対する細胞の感受性を変化させました。SW620 細胞に DARS-AS1 shRNA、DARS-AS1 過剰発現プラスミド、またはコントロール プラスミドをトランスフェクトしました。細胞を thapsigargin で 48 時間処理し、MTS 試薬を使用して細胞の生存率を測定しました。f in vitro 転写されたDARS-AS1またはダミーRNAと精製PACTを in vitro 活性化アッセイと免疫ブロット検出に使用しました。gこれらの抗体を使用した免疫ブロットは、SW620-ctrl細胞（左）またはPKR変異体を過剰発現している細胞（右）で実行されました。次に、これらの細胞にコントロールshRNAまたはDARS-AS1-shRNAをトランスフェクトし、続いて血清飢餓を行いました。hフローサイトメトリーは、変異PKRの不活性化がSW620細胞のDARS-AS1誘導アポトーシスを補償することを示しました。i 示された抗体を用いた免疫ブロットは、SW620 (左) または HCT116 (右) 細胞で実施されました。コントロール shRNA または DARS-AS1 shRNA でトランスフェクトされた細胞は、血清除去され、100 nM PKR C16 阻害剤または DMSO が補充されます。スケール バー = 5 μm。示されているデータは、3 つの実験の平均 ± 標準偏差です。* p ≤ 0.05 スチューデントの両側 t 検定。
一般に、PACT が PKR17 と相互作用すると、Thr451 での PKR リン酸化が誘導されると考えられています。我々の結果は、PKRリン酸化のレベルが血清飢餓後のDARS-AS1ノックダウン細胞で有意に上昇したことを示しました（図4dおよび補足図4a）。したがって、主要なPKR基質であるeIF2αのリン酸化も、DARS-AS1 shRNAによって大幅に増加することがわかりました（図4dおよび補足図4a）。タプシガルギンは小胞体ストレッサーで、小胞体に Ca2+ を放出させます。タプシガルギンによる治療は、PACT の発現と活性化を誘導することが報告されており、PACT はさらに PKR と相互作用して活性化し、eIF2α リン酸化を増加させることによってアポトーシスを引き起こします 18,61 。ここでは、PACT/PKR 経路の刺激因子としてタプシガルギンを使用して、DARS-AS1 が PACT/PKR 経路を阻害することによって細胞がストレスを克服するのを助けることができるかどうかを調査しました。DARS-AS1 発現のレベルは、タプシガルギンに対する細胞耐性と正の相関があることが観察されました。DARS-AS1を過剰発現するSW620細胞は、タプシガルギンで処理すると生存率が高くなりましたが、DARS-AS1をノックダウンした細胞はより感受性になりました（図4e）。これらの結果と一致して、DARS-AS1の過剰発現はタプシガルギン誘発PKRリン酸化を減少させました（補足図4b）。対照的に、タプシガルギン処理後、PKRおよびeIF2αは、対照細胞と比較してDARS-AS1ノックダウン細胞でより高度にリン酸化されました（補足図4b）。興味深いことに、タプシガルギンは用量依存的にDARS-AS1の発現を誘導し、これはDARS-AS1の抗ストレス機能を示している可能性があります（補足図4c）。さらに、これらの観察結果を確認するために in vitro 活性化アッセイを実施しました。簡単に説明すると、PKR は抗 PKR 抗体を使用して細胞溶解物から精製され、組換え PACT および in vitro で転写された DARS-AS1 とインキュベートされました。酵素反応後、WBを用いてホスホ-PKRを検出した。私たちの結果は、PKRリン酸化がDARS-AS1によって有意に阻害されたが、コントロールRNAによっては阻害されなかったことを示しました（図4f）。これらの in vitro および in vivo の結果は、DARS-AS1 が PACT を介した PKR 活性化を阻害することを示唆しています。同時に、DARS-AS1 の存在下で PACT 回復の減少も観察されました (図 4f)。この結果は、in vitro タンパク質結合アッセイの結果 (図 4c) と一致しており、PACT-PKR 結合に対する DARS-AS1 のブロック機能を再度示しています。
PACT の D3 ドメインの Ser246 と Ser287 は、細胞ストレス下での PKR 活性化に必要です。アラニンの 2 つのセリン残基の置換​​は、ストレスの非存在下で PKR を活性化する変異型 PACT (mutD) を生成し、アラニンの置換 (mutA) はプロトコルを逆転させました。DARS-AS1 との直接的な関連におけるこのドメインの重要性を実証したので、これらの 2 つの PACT 変異体を生成して、これらの残基が DARS-AS1 との相互作用にも関与できるかどうかをテストしました。興味深いことに、両方の変異体はDARS-AS1に結合する能力を失い（補足図4d）、DARS-AS1との効率的な相互作用にはPACTタンパク質の完全な構造が必要である可能性があることを示唆しています。
さらに、我々の結果は、DARS-AS1-shRNAによる細胞増殖の阻害は、ドミナントネガティブPACT変異体（PACTmutA）またはドミナントネガティブPKR変異体（PKRmut）を過剰発現させることで部分的に回復できることも示唆しています（補足図4e。e）。ドミナント ネガティブ PKR 変異体の過剰発現は、血清欠乏細胞における DARS-AS1 ノックダウンおよび eIF2α リン酸化によって誘導される PKR リン酸化を減少させました (図 4g)。さらに重要なことに、DARS-AS1ノックダウンによって誘導されるアポトーシス細胞の割合も、PKRmutを過剰発現する細胞で減少しました（図4hおよび補足図4g）。細胞をPKR特異的C16阻害剤で処理した場合、DARS-AS1ノックダウンがPKRおよびeIF2αリン酸化をほとんど引き起こさないことが結果から示されたため、PKRキナーゼ活性の阻害はDARS-AS1機能も損ないます（図4iおよび補足図4h）。）。まとめると、我々の結果は、DARS-AS1がPACTを介したPKR活性化を阻害することにより、少なくとも部分的に細胞増殖を促進することを示唆しています。
腫瘍形成におけるDARS-AS1の役割をさらに調査するために、マウス異種移植モデルを使用して in vivo 実験を行いました。 結果は、DARS-AS1のノックダウンがマウスの腫瘍増殖を劇的に減少させたことを示しています（p値<0.0001）（図5a）。 結果は、DARS-AS1のノックダウンがマウスの腫瘍増殖を劇的に減少させたことを示しています（p値<0.0001）（図5a）。 現在、DARS-AS1 は、最新の状態に保たれています (значение p <0,0001) (рис. 5а). 結果は、DARS-AS1 ノックダウンがマウスの腫瘍増殖を劇的に減少させることを示しています (p 値 < 0.0001) (図 5a)。結果は、DARS-AS1 の低用量がマウスの腫瘍増殖を減少させたことを示しています（p 値 < 0.0001）（図 5a）。結果は、DARS-AS1の低下がマウスの腫瘍増殖を減少させたことを示している（p値<0.0001）（図5a）。 現在、DARS-AS1 は、最新の状態に保たれています。 結果は、DARS-AS1 ノックダウンがマウスの腫瘍増殖を有意に減少させることを示しました (p 値 < 0.0001) (図 5a)。したがって、DARS-AS1 ノックダウン グループでは、平均腫瘍体積が約 72.9% 減少し、平均腫瘍質量が約 87.8% 減少しました (図 5b-d)。これらの結果は、DARS-AS1 が in vivo で腫瘍増殖を有意に促進できることを強く示唆しています。
ヌードマウスの結腸直腸腫瘍形成に対するAD DARS-AS1ノックダウンの効果。成長曲線 (a)、腫瘍サイズ (b)、重量 (c)、および腫瘍画像 (d) が示されています。エラーバーは±SEMを表します。 n = 10。****p < 0.0001、スチューデントの両側 t 検定による。 n = 10。****p < 0.0001、スチューデントの両側 t 検定による。 n = 10. ****p < 0,0001 となる. n = 10。****p < 0.0001 スチューデントの両側 t 検定。n = 10。 ****p < 0.0001、双尾学生による検定。 ****p < 0.0001、双尾学生による検定。 ****p < 0,0001 は、現在の状態を維持します。 ****p < 0.0001 スチューデントの両側 t 検定。e Kaplan-Meier は、UVM、KICH、KIRP、MESO、GBM、および LGG の患者における DARS-AS1 発現レベルと全生存期間との相関関係を分析しました。患者における高レベルの DARS-AS1 発現は、上位 50% に含まれていました。患者の DARS-AS1 発現レベルが低いのは下位 50% でした。p値は、ログランク検定を使用して決定されました。f DARS-AS1がPACT-PKR経路と腫瘍増殖を調節する提案されたモデル。
DARS-AS1 の臨床的影響をよりよく理解するために、その発現と患者の生存率との相関関係を調べました。TCGA データセットを分析することにより、より高い DARS-AS1 発現がブドウ膜黒色腫 (UVM)、腎色素恐怖症 (KICH)、腎乳頭細胞癌 (KIRP)、中皮腫 (MESO)、マルチプレックスと関連していることがわかりました。生存率の低下は、神経膠芽腫の形態形成（GBM）および低悪性度脳神経膠腫（LGG）の患者と有意に関連していました（図5e）。これらの結果は、DARS-AS1 が臨床的な腫瘍の進行に重要な役割を果たしている可能性があり、複数の癌の潜在的な予測バイオマーカーである可能性があることを示唆しています。
この研究では、大規模な CRISPRi 機能スクリーニングを使用して、DARS-AS1 lncRNA が 2 つの重要なストレス応答因子である PACT と PKR を調節することにより、がん細胞のストレスを克服することを確認しました。PACTと直接相互作用することにより、DARS-AS1はPACTを介したPKR活性化を阻害し、それによってアポトーシス細胞死を防ぎ、細胞増殖を促進しました（図5f）。DARS-AS1 のアップレギュレーションは複数の種類のがんで観察されており、ストレスの多い条件下でがん細胞の生存を促進するその機能は、複数の種類のがんに広く適用できる可能性があることを示唆しています。
PACT は PKR 活性化タンパク質として同定されており、PACT を介した PKR 活性化は、転写、翻訳、アポトーシス、およびその他の重要な細胞プロセスを調節することにより、ストレス応答において重要な役割を果たします 62。何十年もの間、PACT-PKR カスケードの癌特異的調節を理解する試みがなされてきました。ここで、私たちの研究は、PACTに直接結合し、PACT-PKR相互作用をブロックし、PKR活性化とeIF2αリン酸化を阻害し、それによってストレス誘導アポトーシスを阻害し、最終的な癌の増殖を刺激します。細胞。この発見は、がんの予後と治療のための潜在的な lncRNA 標的に光を当てます。
私たちのデータは、DARS-AS1ノックダウンがリン酸化PKRとeIF2αの有意な増加により、細胞を血清飢餓に対して感作することを示しました。これらの結果は、DARS-AS1 が PACT/PKR 活性を阻害することにより、過酷な条件下でのがん細胞の生存を促進することを示唆しています。ASPACT や nc886 などの他のいくつかの非コード RNA も、PACT48 mRNA をダウンレギュレートするか、PKR49,50,64 に結合して自己リン酸化を調節することにより、PACT/PKR 軸に関与しています。その中で、DARS-AS1 は PACT-PKR アソシエーションの破壊者として機能します。この研究は、PACT / PKR軸の調節とストレス応答におけるlncRNAの役割についての理解を深めます。
PACT には、3 つの別個のドメインが含まれています。最初の 2 つの dsRBD のそれぞれは PACT の PKR への高親和性結合を達成するのに十分ですが、3 番目のドメイン (D3) は in vitro および in vivo での PKR 活性化に必要です。私たちの研究は、DARS-AS1がD3ドメインと優先的に相互作用することを示しました（図3h）。lncRNA のサイズが大きい場合 (768 ヌクレオチド)、D3 に結合する DARS-AS1 は、dsRBD の PACT ドメインと PKR の間の相互作用を物理的に阻害し、それによって PACT と PKR の結合をブロックします。D3 の Ser246 および Ser287 をアラニンまたはアスパラギン酸に置換した PACT 点突然変異は、DARS-AS1 に対する結合親和性を破壊し、それらの関連における D3 の全体的な構造的および電気的特性の重要性を指摘しました。このメカニズムのさらなる詳細は、より正確な生化学分析と高解像度の PACT 構造分析を使用して、将来必要になります。
以前の研究では、DARS-AS1 がいくつかのメカニズムを通じて細胞増殖を促進することが報告されています 51,52,53。一例として、研究者らは、DARS-AS1 が腎臓癌細胞の miP-194-5p を標的とすることにより、アンチセンスタンパク質をコードする DARS 遺伝子をアップレギュレートすることを観察しました。しかし、本研究では、DARS-AS1 ノックダウンは、少なくとも結腸直腸癌、乳癌、肝臓癌を含む複数の種類の癌における DARS 転写にほとんど影響を与えませんでした。lncRNAは細胞特異的および組織特異的な発現パターンを示すため、機能メカニズムはがんの種類間で保存されていない可能性があり、これが私たちの観察と異なるがんの以前の評価との間のこの不一致に寄与している可能性があります。さまざまな生理学的および病理学的プロセスの特定のメカニズムを解明するには、特別な研究が必要です。
臨床データの分析により、腫瘍における DARS-AS1 発現ががん患者の生存率と逆相関することが示されました。これは、がんの予後における DARS-AS1/PACT/PKR 軸の重要性を強調しています。結論として、私たちの研究は、DARS-AS1がPACT / PKRシグナル伝達軸の調節因子であり、癌細胞の増殖を促進し、ストレス応答中にアポトーシスを阻害することを示しています。 .
ヒト細胞株 SW620、A549、MBA-MD-231、HCT116、HepG2、および HEK293T は、中国の National Cell Line Resource Infrastructure から入手しました。すべての細胞は、10% FBS (Gemini、ニューヨーク州ブルックリン) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Thermo Fisher Scientific) を添加した DMEM 培地 (DMEM、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) で 37°C、5% CO2 で維持しました。インキュベータ。
抗PACT、アブカム（ab31967）;抗PKR、アブカム（ab184257）;抗 PKR (ホスホ T451)、Abcam (ab81303);アンチフラグ、アブカム (ab125243);抗eIF2α、アブカム（A0764））;抗eIF2α（リンS51）、Abcam（ab32157）;抗PACT（リンS246）、Abgent（AP7744b）;抗β-チューブリン、CST (2128);正常なマウス IgG、CST (5415S);通常のウサギ IgG、CST (2729S)。抗体は、ウェスタンブロッティングでは PBST で 1:1000 に希釈し、IP では 1:100 で希釈しました。
sgRNA は、CRISPR-ERA66 と呼ばれる公開ツールを使用して開発されました。sgRNA 開発にはデフォルトのツール パラメーターを使用し、アルゴリズムは 3 kb 領域の sgRNA 結合部位を計算しました。TSSが中心。sgRNA オリゴヌクレオチドのプールは CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) で合成され、ヒト化 pgRNA プラスミド (Addgene #44248) にクローニングされました。合計 12 μg のプールされたヒト化 pgRNA プラスミド、7.2 μg の psPAX2 (Addgene #12260)、および 4.8 μg の pMD2.G (Addgene #12259) を、DNAfect Transfection Reagent を使用して 10 cm ディッシュの 5 x 106 HEK293T に同時トランスフェクトしました。製造元の指示に従ってセル (CWBIO、北京、中国)。トランスフェクションの 48 時間後および 72 時間後にウイルスを含む上清を回収し、0.45 µm フィルターでろ過しました。スクリーニングのために、dCas9/KRAB融合タンパク質を発現するSW620細胞をウイルス形質導入によって得た。0.1～0.3のMOIで4回の独立した感染実験において改変SW620細胞をウイルスライブラリーに感染させ、2μg/mlのピューロマイシン(Sigma、ミズーリ州セントルイス)で2日間サンプリングした。その後、細胞を in vitro で 18 日間培養し、スクリーニングのために 500 細胞/sgRNA の最小ライブラリー範囲をカバーしました。
QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN、デュッセルドルフ、ドイツ、51183) の説明書に従って、ゲノム DNA を抽出しました。合計で、生物学的反復あたり 100 μg のゲノム DNA を使用してライブラリーを構築しました。sgRNA 領域は、2 ラウンドの PCR によって増幅され、バーコードにリンクされました。
NucleoSpin® ゲルおよび PCR 精製キット (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) を使用して PCR 産物を精製し、Qubit™ HS 二本鎖 DNA 検出キット (Thermo Fisher Scientific; Q32854) を使用して定量化しました。
MTS アッセイは、細胞増殖を測定するために使用されました。細胞を 2000 細胞/ウェルの初期密度で 96 ウェル プレートに播種しました。細胞の相対数は、合計4〜6日間、指定された時間に毎日測定されました。各ウェルについて、20μlのMTS試薬(Promega)を100μlのDMEMで希釈し、細胞と共に37℃で4時間インキュベートし、その後OD490を測定した。
固定されていない成長の能力は、球体の形成を分析することによって発見されました。簡単に言えば、shRNA DARS-AS1またはコントロールshRNAでトランスフェクトされた2000個の細胞を、4日ごとに培地を交換しながら超低接着マイクロプレート（Corning）で培養しました。スフェロイドは 14 日後にカウントされました。DARS-AS1過剰発現プラスミドまたはコントロールプラスミドでトランスフェクトされた500個の細胞を増強アッセイに使用しましたが、それ以外の方法は変更されていません。
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) の説明書に従って、T7 RNA ポリメラーゼおよびビオチン-16-UTP (Roche 1138908910) を使用して RNA を転写しました。ここで使用されるプライマーは、補足表 4 に一覧表示されています。
タンパク質をコードする PACT または PKR 領域を pET15b (Addgene #73619) にクローニングし、BL21(DE3) に形質転換しました。細菌を、アンピシリンが供給された LB で一晩インキュベートし、その後、新鮮な LB で 100 倍に希釈しました。培地の OD600 が 0.8 に達した時点で、1 mM IPTG を添加してタンパク質発現を誘導しました。穏やかに振とうしながら（20℃で250rpm）一晩インキュベーションした後、遠心分離（4000rpm、10分、4℃）によって細胞ペレットを回収した。溶解バッファー (50 mM Tris、pH 8.0、250 mM NaCl、1 mM PMSF) で細胞ペレットを再懸濁し、氷上で 30 分間インキュベートし、超音波処理 (15 分、5 秒オン/オフ、氷上) および遠心分離 (13,000 rpm)。、30 分、4°С)。次に、上清を Ni-NTA 樹脂 (QIAGEN) に 4°C で 3 回ロードし、洗浄バッファー (50 mM Tris、pH 8.0、40 mM イミダゾール、250 mM NaCl) で 4 回洗浄し、3 回溶出しました。 10 ml の溶離液バッファー (50 mM Tris、pH 8.0、250 mM NaCl、300 mM イミダゾール)。精製タンパク質は WB を使用して決定し、濃度は Qubit™ タンパク質アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) を使用して決定しました。
RIPアッセイは、前述のように変更を加えて実行されました。簡単に説明すると、1x RIP バッファー (25 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、0.5% NP-40、RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤 (Promega)、PMSF (Beyotime Biotechnology)、1 mM DDM、プロテアーゼ) は細胞増殖抑制剤を溶解します 1 x 107 カクテル(ロシュ、1 mM DTT) と 4 ° C で 15 分間 13,000 rpm で遠心分離します。次いで、上清を、５μｇの抗ＰＡＣＴ抗体（Ａｂｅａｍ）またはＩｇＧ（ＣＳＴ）とコンジュゲートしたプロテインＡ＋Ｇ磁気ビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベートした。ビーズを 5x RIP バッファーで 5 回洗浄した後、プロテイナーゼ K (NEB) で消化しました。RNAをTrizolで抽出し、RT-qPCRで測定しました。プライマーは補足表5に示されています。
インビトロ RIP アッセイは、修正された標準 RIP アッセイ プロトコルに従って実行されました。合計 5 pmol の in vitro 転写 RNA を RIP バッファーで 1 倍に希釈し、65°C で 5 分間インキュベートしてアニールし、室温までゆっくりと冷却しました。合計 5 pmol の無傷または変異フラグ標識 PACT タンパク質が大腸菌から精製されました。復元した RNA とともに 4°C で 2 時間インキュベートし、上記の手順に従って、抗フラグ IP の RIP 解析を行います。
RNA伸長分析のために、1×107個の細胞を1×RIP緩衝液で溶解した。4℃で13,000 rpmで15分間遠心分離した後、上清を30μlのストレプトアビジン磁気ビーズ（Beckman）で4℃で2時間前処理しました。次に、精製されたライセートに酵母 tRNA を供給し、40 pmol の再生 RNA とともに 4 °C で一晩インキュベートし、さらに 2 時間インキュベートし、BSA でブロックされた新しいストレプトアビジン磁気ビーズ 20 μl を加えました。洗浄ステップは、5x RIP バッファーで 4 回、1x RIP バッファーで 4 回で構成されていました。対応するタンパク質をビオチン溶出バッファー (25 mM Tris-HCl、pH 7.5、12.5 mM D-ビオチン、PMSF) で溶出し、NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) で分離しました。銀染色 (Beyotime Biotechnology) の後、特定のバンドを切り出し、MS で分析しました。
Co-IP 分析は、PACT と PKR の間の相互作用をテストするために実行されました。簡単に説明すると、1 x 107 個の溶解細胞を 1 x RIP バッファーでインキュベートし、続いて 13,000 rpm で 15 分間、4°C で遠心分離することにより、上清溶解物を調製しました。ライセートにプロテイン A + G 磁気ビーズをロードし、5 μg の抗 PACT 抗体と結合させ、4°C で一晩穏やかに回転させました。ビーズを５×ＲＩＰ緩衝液で３回、１×ＲＩＰ緩衝液で２回洗浄し、１×ＳＤＳ緩衝液で溶出した。回収したタンパク質をSDS-PAGEゲルで分析し、WBで検出した。
2 pmol のフラグ付き PACT と 1 pmol の PKR が大腸菌から精製されました。1 × RIP バッファーで希釈し、10 pmol の再生 RNA とともに 4 °C で 2 時間インキュベートします。その後、それらをプロテインA+G磁気ビーズ結合抗標識抗体と共にさらに2時間インキュベートした。次いでビーズを１×ＲＩＰ緩衝液で４回洗浄し、１×ＳＤＳ緩衝液で溶出した。結果の PACT と PKR は WB によって検出されました。